Proteíny HDM2 a HDMX v ľudských nádoroch

Overview

Východiská:

Proteíny HDM2 a HDMX sú hlavné negatívne regulátory tumorového supresoru p53. Ich úlohou je udržiavať nízku hladinu proteínu p53 za normálnych podmienok. V stresových podmienkach je však táto negatívna regulácia prerušená, čo umožní aktiváciu p53 dráhy. V mnohých ľudských nádoroch, ktoré si zachovávajú wild type p53, bola nájdená nadmerná expresia proteínov HDM2 a HDMX, ako napr. v sarkóme. A tak okrem inaktivujúcej mutácie v géne pre proteín p53, modulácia expresie proteínov HDM2 a HDMX predstavuje alternatívny mechanizmus inaktivácie signálnej dráhy p53.

Cieľ:

V tomto zhrnutí stručne predstavíme funkciu proteínov HDM2 a HDMX, zhrnieme informácie o zvýšenom výskyte proteínov HDM2 a HDMX v ľudských nádoroch, jeho možné príčiny a predstavíme rôzne prístupy k potenciálnej liečbe nádorov založenej na cielení na proteíny HDM2 a HDMX.

Záver:

HDM2 a HDMX sa stali zaujímavými cieľmi protinádorovej terapie, kedy prerušenie negatívnej regulácie p53 pomocou látok, ako napr. nutlinov, môže viesť k reaktivácii p53 odpovede a k potlačeniu rakovinového bujenia. Nové poznatky o funkcii a štruktúre proteínov HDM2, HDMX a p53 umožňujú návrh nových druhov terapeutík, čo môže prispieť k špecifickej liečbe a efektívnejšej odpovedi pacientov. Mnohé z látok sú už testované v rámci klinických štúdií fáze I, II a III.

Kľúčové slová:

HDM2 – HDMX – signálna dráha p53 – onkogény – MDM2 – MDMX

Úvod

Proteíny HDM2 (human double minute 2 proteín, nazývaný aj MDM2) a HDMX (human double minute X proteín, nazývaný aj MDMX, MDM4, HDM4) sú paralógne proteíny patriace do rodiny MDM (mouse double minute). Obidva proteíny hrajú nezastupiteľnú úlohu v regulácii stability p53, ale podieľajú sa aj na mnohých iných procesoch, ako napr. opravách poškodenej DNA, translačnej regulácii, regulácii ribozomálneho stresu [1]. Významný vplyv proteínov HDM2 a HDMX bol preukázaný in vivo na myších modeloch. Myši s MDM2–/– a MDMX–/– vykazovali veľmi skorú embryonálnu letalitu a zároveň bolo zistené, že tejto letalite sa dá zabrániť, pokiaľ je vyradený aj proteín p53 [2,3]. Sú to onkogénne proteíny, ktoré sú často nadmerne exprimované, najmä v tumoroch s wild type p53. Pri nadmernej expresii sú zodpovedné za nadmerné odbúravanie proteínu p53, obmedzenie jeho transkripčnej funkcie, ale spôsobujú aj genómovú nestabilitu a tým všetkým prispievajú ku vzniku nádorov. Dlhodobý výskum v oblasti MDM proteínov poukazuje na ich neprekrývajúce sa, ale doplňujúce sa funkcie v regulácií p53 signálnej dráhy a iných. Vďaka novým poznatkom sú vyvíjané liečivá, ktoré špecificky cielia na obmedzenie funkcie nie len HDM2 proteínu, ale aj HDMX.

Funkcia proteínov HDM2 a HDMX

Najlepšie preštudovanou a pravdepodobne aj najdôležitejšou úlohou proteínov HDM2 a HDMX je ich regulácia proteínu p53, a to skrz vplyv na stabilitu, ale aj transkripčnú aktivitu proteínu p53. Hladina proteínu p53 musí byt prísne regulovaná v závislosti na podmienkach. V normálnych podmienkach je potrebné, aby bola hladina p53 nízka a bunka mohla prechádzať bunkovým cyklom. V tomto prípade proteíny HDM2 a HDMX interagujú s proteínom p53 a spôsobujú jeho proteazomálnu degradáciu. Proteín HDM2 svojou E3-ligázovou aktivitou v súčinnosti s E2-ligázou katalyzuje polyubikvitináciu proteínu p53 na lyzínoch v DNA-väzbovej a C-terminálnej doméne. Takto označený proteín p53 je odbúraný pomocou proteazómu [4]. Proteín HDMX nie je funkčnou E3 ligázou, ale svojou schopnosťou tvoriť heterodiméry s proteínom HDM2 priamo zvyšuje účinnosť ubikvitinácie proteínu p53 [5,6]. Ďalší mechanizmus, akým môže HDM2 a HDMX ovplyvniť funkciu p53, je skrz blokovanie transkripčnej aktivity p53. Proteín HDM2 aj HDMX sa viaže do N-terminálnej transaktivačnej domény p53. Naviazanie proteínu HDM2 skrz transaktivačnú doménu p53 blokuje možnosť proteínu p53 viazať sa s transkripčnou mašinériou [7,8]. Avšak s využitím myších modelov, ktoré exprimovali HDM2 s mutovanou RING (really interesting new gene) doménou bez schopnosti ubikvitinácie, bolo preukázané, že hlavný mechanizmus, akým HDM2 potláča funkciu p53, je skrz jeho odbúravanie cez proteazóm, a nie cez blokovanie transkripčnej aktivity [9]. Proteín HDMX sa viaže s proteínom p53 taktiež cez svoju N-terminálnu doménu. Tejto väzbe bola taktiež pripisovaná schopnosť blokovať transkripčnú aktivitu proteínu p53 [10]. Neskôr boli identifikované aj interakcie ďalších domén vedúcich k ovplyvneniu transkripčnej aktivity proteínu p53, a to kyslej domény HDM2 a DNA-väzbovej domény p53 [11,12] a taktiež kyslej domény HDMX a DNA-väzbovej domény p53, čo vedie k inhibícii väzby p53 k DNA [13]. Interakcia HDM2-HDMX-p53 je veľmi komplexná a je závislá na alosterických zmenách všetkých troch proteínov [14].

V prípade stresových podmienok, ako je napr. poškodenie DNA, je potrebné, aby sa rýchlo zvýšila hladina proteínu p53 a ten mohol vykonať svoju funkciu (zastavenie bunkového cyklu v prípade menšieho poškodenia alebo vyvolanie apoptózy v prípade väčšieho poškodenia). V tomto prípade je nevyhnutné, aby bola interakcia p53 s proteínmi HDM2 a HDMX prerušená. V prípade poškodenia DNA je aktivovaná ATM kináza (ataxia-telangiectasia mutated), ktorá vedie k fosforylácii proteínu p53 na Ser15 a proteínov HDM2 na Ser395 a HDMX na Ser403. Proteíny HDM2 a HDMX sú po fosforylácii schopné efektívnejšie viazať p53 mRNA a prerušuje sa interakcia s proteínom p53 [15–17]. Ubikvitinačná aktivita proteínu HDM2 je presmerovaná na samotný proteín HDM2 a HDMX, čím dochádza k ich odbúravaniu [18].

Po odpovedi p53 je nutné, aby sa hladina proteínu p53 opäť znížila. K tomu je potrebné, aby bola obnovená dostatočná hladina proteínov HDM2 a HDMX. To je zabezpečené spätno-väzbovou reguláciou, kedy zvýšená hladina p53 vedie k aktivácii transkripčného programu p53. Dochádza k prepisu génov HDM2 a HDMX a novo vzniknuté proteíny HDM2 a HDMX sa môžu opäť podieľať na odbúraní proteínu  p53 [19–21].

Interakcia proteínu p53 s HDM2 a HDMX je regulovaná mnohými proteín-proteínovými interakciami. Proteín HDM2 interaguje s plejádou rôznych proteínov, ktoré majú dopad na funkciu proteínu p53. Napríklad proteín ARF (alterante reading frame protein) sa viaže do kyslej domény HDM2, blokuje E3-ligázovú aktivitu HDM2 voči p53 a blokuje export proteínu p53 z jadra závislý na HDM2 [22]. HDMX taktiež interaguje s proteínom ARF, čím ovplyvňuje stabilitu proteínu HDM2 [23,24]. Medzi ďalšie interagujúce proteíny patria ribozomálne proteíny, ako napr. RPL5, RPL11, RPL23, ktoré taktiež limitujú E3-ligázovú funkciu HDM2 [25]; proteín p300, ktorý tvorí komplex s HDM2 aj HDMX a umožňuje aktiváciu p53 v stresových podmienkach [26,27] a mnohé iné.

Okrem vplyvu proteínov HDM2 a HDMX na aktiváciu p53 odpovede bola popísaná aj ich funkcia nezávislá na proteíne p53. Obidva proteíny inhibujú opravu poškodenia DNA skrz ich asociáciu s DNA-reparačným komplexom MRN tvoreným proteínmi MRE11/RAD50/NBS1 (meiotic recombination 11 homolog 1/DNA repair protein RAD50/DNA repair and telomere maintenance protein NBS1). HDM2 aj HDMX sú viazané ku komplexu skrz proteín NBS1 a spôsobujú spomalenie opráv DNA. Takýmto spôsobom obidva proteíny môžu prispievať ku genómovej nestabilite a tumorigenéze [28]. Taktiež bola popísaná ich účasť v kontrole translácie určitých proteínov skrz ich väzbu k mRNA. V prípade HDM2 tak bol popísaný okrem kontroly translácie proteínu p53 [16] aj vplyv na transláciu proteínov XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein) [29], SLUG (taktiež nazývaný SNAI2 – protein snail homolog 2) [30], MYCN (N-myc proto-oncogene protein) [31], VEGF (vascular endothelial growth factor) [32].

Štruktúra proteínov HDM2 a HDMX

Proteíny HDM2 a HDMX sú paralógne proteíny zhodné na 30 % svojou sekvenciou. Obidva proteíny sú zložené zo 4 usporiadaných domén, medzi ktorými sa nachádzajú veľké úseky vnútorne neusporiadaných častí (obr. 1).

Na N-terminálnom konci obidvoch proteínov sa nachádza p53 väzbová doména, ktorá je v proteínoch zhodná z 71 % a je zodpovedná za väzbu a reguláciu proteínu p53. Aminokyseliny, ktoré sú nevyhnutné pre väzbu s proteínom p53, sú konzervované u obidvoch proteínov [10] a taktiež proteín p53 využíva na väzbu k obidvom proteínom rovnaké aminokyseliny [33]. Avšak dôkladná röntgenová štruktúrna analýza odhalila rozdiely v usporiadaní p53 väzobnej kapsy u proteínu HDM2 a HDMX. V prípade proteínu HDMX postranné reťazce dvoch aminokyselín spôsobujú uzavretejšiu konformáciu hydrofóbnej štrbiny, ktorá sa viaže k p53 [34].

Za N-terminálnou doménou sa nachádzajú neusporiadané časti proteínov. Proteín HDM2 obsahuje sekvenciu nazývanú jadrový lokalizačný signál (nuclear localization signal – NLS), ktorá umožňuje premiestenie proteínu do jadra. Za ňou sa nachádza sekvencia nazývaná signál pre export z jadra (nuclear export signal – NES), umožňujúca naopak export proteínu z jadra do cytoplazmy. Proteín HDMX tieto signály neobsahuje. Je primárne lokalizovaný v cytoplazme bunky, avšak na základe interakcií s inými proteínmi, ako napr. s HDM2, môže byť premiestnený do jadra a späť [35]. Proteín HDMX naviac obsahuje za N-terminálnou doménou autoregulačný sekvenčný motív (aminokyseliny TRP200 a TRP201) nazývaný aj WW motív. Ten sa viaže k p53 väzbovej doméne na N-terminálnom konci samotného HDMX a tým blokuje schopnosť proteínu viazať sa k p53. Strata tohto motívu vedie až k 32-násobnému navýšeniu väzby HDMX s proteínom p53 [36].

V centrálnej časti proteínov sa nachádza kyslá doména (acidic), kde je prítomných viacero kyslých aminokyselín. V proteíne HDM2 hrá táto doména pomocnú úlohu pri degradácii proteínu p53 [37,38]. Najnovšie poznatky ukazujú, že kyslá doména proteínu HDMX je taktiež dôležitá pri regulácií p53, a to cez väzbu kyslej domény HDMX k centrálnej DNA väzbovej doméne proteínu p53, čím dochádza k zablokovaniu funkcie proteínu p53 [13,39]. Za kyslou doménou sa nachádza doména zinkového prstu. Tvorí miesto pre interakciu s mnohými proteínmi, napr. s inhibítorom proteínu HDM2, proteínom ARF [40]. Táto doména je taktiež kľúčová pri väzbe s ribozomálnymi proteínmi RPL5, RPL11, RPL23. Mutácie v zinkovom prste (najmä v jednom z cysteínov, ktoré tvoria štruktúru C4 zinkového prstu) narúšajú správnu funkciu proteínu HDM2 a sú spájané s predispozíciou vzniku rakoviny [41].

Na C-konci proteínov HDM2 a HDMX sa nachádza RING doména, ktorá je opäť veľmi konzervovaná. RING doména  proteínu HDM2 je priamo zodpovedná za degradáciu p53, a to svojou  E3-ubikvitin ligázovou aktivitou. Napriek veľkej sekvenčnej homológii RING domény (72 %), HDMX nie je funkčnou E3 ligázou. RING doména obidvoch proteínov slúži aj k proteín-proteínovým interakciám s inými RING-obsahujúcimi proteínmi. Dochádza najmä k interakcii medzi proteínmi HDM2 a HDMX, tzv. heterodimerizácii, ktorá zvyšuje stabilitu proteínov HDM2 a HMDX [42]. Proteín HDM2 vytvára cez RING doménu aj homodiméry. Táto vlastnosť nebola u HDMX pozorovaná. Obidva proteíny obsahujú v svojej RING doméne  P-slučku, ktorá umožňuje väzbu molekúl adenosintriphosphate (adenozíntrifosfátu – ATP) [43,44]. RING doméne je pripisovaná aj schopnosť viazať sa špecificky k určitému typu RNA, ako napr. k p53 mRNA [15,17], k XIAP mRNA [45].

Proteíny HDM2 a HDMX majú v plnej dĺžke 491 a 490 aminokyselín. Skrz alternatívny zostrih sú v bunkách prítomné aj rôzne izoformy proteínov, čo predstavuje ďalšiu rovinu regulácie nie len ich možnej štruktúry, ale aj ich  funkcie [46].

Hladina proteínov HDM2 a HDMX v nádoroch

Proteín MDM2 (mouse double minute 2, myší homológ ľudského proteínu HDM2) bol prvýkrát objavený v myších bunkách 3T3-DM na základe zvýšeného výskytu amplifikácie génu MDM2 [47]. Neskôr bola popísaná jeho asociácia s proteínom p53 a bol pozorovaný represívny vplyv proteínu MDM2 na transkripčnú aktivitu proteínu p53 [48]. Už v roku 1992 Oliner et al pozorovali zvýšenú hladinu proteínu HDM2 u približne jednej tretiny prípadov ľudského sarkómu. Zaujímavou skutočnosťou je, že tieto prípady sarkómu si zachovávali wild type formu proteínu p53 [49]. Neskoršie štúdie na väčšom počte vzoriek potvrdili amplifikáciu HDM2 v mnohých podtypoch sarkómu, ako napr. v osteosarkóme, liposarkóme, lipóme [50–54]. Zvýšená hladina HDM2 bola pozorovaná na úrovni proteínu aj na úrovni mRNA. Mnohé štúdie preukázali zvýšenú hladinu proteínu HDM2 v rôznych typoch rakoviny, ako napr. v malignom glióme [55], v rakovine prsníka [56,57], v rakovine pľúc [58].

Proteín HDMX bol objavený ako ďalší regulátor p53 na základe svojej podobnosti na proteín HDM2 a svojej schopnosti priamo interagovať s proteínom p53 [10]. Tak ako HDM2, aj HDMX je nadmerne exprimovaný v niektorých typoch rakoviny. Jeho zvýšený výskyt bol pozorovaný u podobných typov rakoviny ako v prípade HDM2, napr. v glioblastóme [59], v sarkóme [60] a v rakovine prsníka [61,62]. Naviac bol pozorovaný zvýšený výskyt proteínu HDMX aj v retinoblastóme, kde môže zohrávať hlavnú úlohu v inaktivácii signálnej dráhy p53 v RB1-deficientných bunkách (retinoblastoma protein 1 – RB1) [63].

Stanovenie hladiny proteínov HDM2 a HMDX odhalilo, že proteíny sú exprimované rôzne v závislosti na type tkaniva a podmienok. Avšak porovnaním normálnych a rakovinových buniek sa preukázala nadmerná expresia týchto onkoproteínov takmer vo všetkých typoch nádorov a môže byť spôsobená skrz génovú alteráciu amplifikáciou génov, alebo nadmernou transkripčnou aktiváciou, transláciou a post-translačnými modifikáciami.

Z hľadiska génovej alterácie proteíny HDM2 a HDMX, na rozdiel od ich hlavného interakčného partnera p53, sú mutované len výnimočne. Najčastejšou alteráciou je už zmienená génová amplifikácia. V roku 2016 Oliner et al analyzovali dostupné dáta týkajúce sa alterácie génu HDM2 z databázy The Cancer Genome Atlas. Kritérium pre relevantnú HDM2 amplifikáciu autori nastavili ako vzájomnú výhradnosť s mutáciou proteínu p53. To znamená, že za amplifikáciu HDM2 bol považovaný taký počet kópií génu, kedy zvýšená hladina HDM2 a mutácia p53 sa nevyskytovali zároveň v tej istej vzorke. Takto bola stanovená amplifikácia HDM2 u 1,2 % vzoriek primárnych tumorov, avšak distribúcia medzi typmi tumorov bola veľmi rozdielna s najčastejším výskytom v sarkóme (18,7 %), glioblastóme (7,2 %) a uroteliálnom karcinóme (2,9 %) [64].

Podľa portálu cbioportal.org [65] sú gény HDM2 a HDMX spolu s génom TP53 (kódujúcim proteín p53) alterované až v 43 % skúmaných vzoriek. TP53 je alterovaný v 39 % skúmaných vzoriek, s najčastejším výskytom mutácií. V 3 % vzoriek bola nájdená alterácia HDM2 a v 4 % vzoriek bola nájdená alterácia HDMX (obr. 2A). Zastúpenie daných alterácií sa výrazne líši podľa typu rakoviny (obr. 2B). Gén TP53 je alterovaný výrazne v mnohých typoch rakoviny najmä skrz mutácie, s najvyšším výskytom v ovariálnom a cervikálnom karcinóme. V prípade cervikálneho karcinómu môžeme pozorovať, že amplifikácia HDM2 a HDMX je takmer výnimočná. Najvýraznejšia amplifikácia HDM2 sa vyskytuje v sarkóme mäkkých tkanív (takmer 20 %). HDMX je amplifikovaný najčastejšie v karcinóme prsníka (takmer 14 %).

Ďalšou príčinou zvýšenej hladiny proteínov HDM2 a HDMX môže byť aj polymorfizmus jedného nukleotidu (single nucleotide polymorphism – SNP). V géne HDM2 bol dôkladne skúmaný polymorfizmus na dvoch miestach, SNP309 a SNP285. Polymorfizmus v mieste 309 sa nachádza v prvom intróne promótora HDM2 P2. Promótor P2 vo variante SNP309 G/G vykazuje 2× vyššiu afinitu pre transkripčný faktor Sp1 a vedie k efektívnejšej transkripcii génu v porovnaní s formou promótora SNP309 T/T [66]. Variant alel SNP309 G/G bol spojovaný s vyššou pravdepodobnosťou nádorových ochorení [66,67], avšak mnohé štúdie na rôznych typoch rakoviny poukazujú na nejednoznačnú spojitosť polymorfizmu SNP309 s nádorovými ochoreniami [68–71]. Naopak polymorfizmus SNP285 je spájaný s nižším výskytom rakoviny. Prítomnosť alely SNP285C potláča zvýšenú afinitu Sp1 vyvolanú variantou SNP309G [72]. Avšak táto súvislosť nebola pozorovaná napr. v karcinóme pľúc [73]. Novšie štúdie naznačujú, že vzájomné porovnanie výskytu jedného a druhého polymorfizmu v konkrétnych tkanivách a vztiahnutie výsledkov na konkrétny typ populácie môže prispieť k jednoznačnejším výsledkom [74]. V géne HDMX boli taktiež sledované polymorfizmy jedného nukleotidu spájané s inaktiváciou proteínu p53, a to SNP1, SNP7, SNP9 a SNP12 [75]. Ďalším študovaným polymorfizmom HDMX je SNP34091 A > C, avšak jednoznačné spojenie s výskytom v určitých typoch rakoviny zatiaľ nebolo preukázané [76,77].

Regulácia hladiny proteínov HDM2 a HDMX

Hladina proteínov HDM2 a HDMX je regulovaná na úrovni transkripcie, translácie a posttranslačných procesov. Medzi transkripčné procesy vedúce k nadmernej expresii proteínov HDM2 a HDMX patrí signalizácia skrz dráhu Ras, ktorá aktivuje transkripčný faktor ETS, a ten vedie k prepisu génov HDM2 a HDMX [78,79]. Na transkripčnej regulácii génu pre HMD2 sa podieľa aj hlavný interakčný partner, proteín p53. Aktivácia proteínu p53 vedie k spusteniu transkripcie génu HDM2, a tak dochádza k spätnoväzbovej regulácii. HDM2 môže opäť ubikvitinovať p53, čím zníži jeho hladinu. V prípade proteínu HDMX dlho nebol pozorovaný priamy vplyv proteínu p53 na transkripciu tohto génu. Neskôr bola aj u HDMX, tak ako predtým u HDM2, popísaná transkripčná aktivácia proteínom p53 z miesta druhého promótora, na rozdiel od bazálnej transkripcie začínajúcej z prvého promótora [20,21]. Boli popísané aj ďalšie transkripčné faktory podieľajúce sa na regulácii transkripcie HDM2, ako napr. IRF8, Sp1 [80].

Ako jedným z posttranskripčných procesov ovplyvňujúcich hladinu proteínov HDM2 a HDMX boli popísané rôzne  mikroRNA. Napríklad mir-192, mir-194 a mir-215, ktoré sú ovplyvňované proteí-nom p53, znižujú hladinu HDM2 [81]. mir-34a sa viaže do miesta SNP34091 v mRNA pre HDMX a vedie k zníženej hladine proteínu HDMX [82]. Vplyv týchto interakcií však nebol zatiaľ potvrdený v in vivo experimentoch, a preto sú ďalšie štúdie nutné k objasneniu významu a možnému využitiu [83].

Posttranslačné modifikácie tvoria významný mechanizmus regulácie proteínov HDM2 a HDMX skrz vplyv na ich stabilitu a funkciu. Dôležitú úlohu zohrávajú mnohé kinázy vedúce k fosforylácii na špecifických miestach proteínov. Medzi kinázy, ktoré vyvolávajú zvýšenú stabilitu proteínov HMD2 a HDMX a následnú inaktiváciu p53, patria najmä Akt kinázy (thymomas of AKR mice) HDM2 je fosforylovaný Akt kinázou na Ser166 a Ser186 [84], HDMX na Ser367 [85]. ATM kináza naopak reprezentuje fosforylačný enzým vedúci k odbúravaniu proteínov HDM2 a HDMX. Proteín HDM2 je primárne fosforylovaný na Ser395 [86] a HDMX na Ser403 [87]. Takto fosforylované proteíny HDM2 a HDMX majú zvýšenú afinitu voči p53 mRNA [15,17,88]. Fosforylácia a zároveň väzba s p53 mRNA znemožnia ich schopnosť viazať p53 proteín, a tak dochádza k aktivácii p53 dráhy [18]. Fosforylácia taktiež mení ubikvitinačnú aktivitu proteínu HDM2, pretože namiesto ubikvitinácie p53, proteín HDM2 ubikvitinuje sám seba a proteín HDMX [18]. Fosforylácie v týchto miestach boli skúmané aj na myších modeloch a bolo ukázané, že skutočne hrajú úlohu v odpovedi na poškodenie DNA [89,90].

Z uvedených príkladov je zrejmé, že hladina proteínov HDM2 a HDMX je regulovaná na viacerých úrovniach. Narušenie správnej regulácie môže viesť k nadmernej expresii HDM2 a HDMX. Avšak zatiaľ nie je úplne známe, akým podielom sa môžu rôzne mechanizmy účastniť na onkogénnom pôsobení HDM2 a HDMX.

Využitie HDM2 a HDMX v liečbe ľudských nádorov

Proteíny HDM2 a HDMX sú kľúčové regulátory proteínu p53 s neprekrývajúcou sa funkciou. Zásah do regulačnej osy proteínu p53 cez tieto dva negatívne regulátory je tak prirodzenou možnosťou, ako potenciovať proteín p53 k vykonávaniu jeho protinádorovej aktivity. Vďaka dôkladnému poznaniu štruktúry a funkcie proteínov HDM2 a HDMX bolo navrhnutých viacero liečebných prístupov:

1. cielenie na proteín-proteínovú interakciu medzi HDM2-p53 a HDMX-p53;
2. cielenie na zmenu transkripčnej aktivity pre gény HDM2 a HDMX;
3. cielenie na ubikvitinačnú funkciu RING domény;
4. cielenie na heterodimerizáciu proteínov HDM2 s HDMX;
5. cielenie na translačnú kontrolu sprostredkovanú proteínom HDM2.

Jeden z prvých prístupov aktivujúcich p53 dráhu skrz inhibíciu proteín-proteínovej interakcie medzi HDM2 bol popísaný už v roku 2004 Vassilevom et al za použitia nízkomolekulárnych látok, nutlinov [91]. Nutliny sa špecificky viažu do hydrofóbnej kapsy proteínu HDM2, a tak znemožňujú naviazanie proteínu p53. Tým dochádza k akumulácii proteínu p53, aktivácii dráhy p53, zástave bunkového cyklu a apoptóze. Tieto látky prešli aj do klinických štúdií fázy I pod názvom RG7112 alebo RO5045337 (klinické štúdie č. NCT01677780, NCT01164033, NCT01605526, NCT01143740, NCT0062 3870, NCT00559533, NCT01635296). Boli testované na rôznych solidných tumoroch, leukémii a i. ako monoterapia, ale aj v kombinácii s liečivami ako doxorubicin či cytarabin. Avšak bola zaznamenaná vysoká hematologická toxicita tejto látky [92]. Neskôr boli vyvinuté nutliny druhej generácie s vyššou účinnosťou a menšími vedľajšími efektmi, ako napr. idasanutlin [93]. Tieto látky boli testované ako monoterapia, ale aj ako kombinovaná liečba s inými liečivami, napr. s cisplatinou, s Poly (ADP-ribóza) polymerázou (PARP) inhibítormi v preklinických štúdiách [94,95]. Pod názvom RG7388 alebo RO5503781 sú zaradené aj v klinických štúdiách fázy I a II opäť ako monoterapia alebo v kombinácii s liečivami, ako napr. obinutuzumab, idarubicin a i. (fáza I – NCT01462175, NCT01773408, NCT01901172, NCT033 62723, NCT02828930, NCT02624986, NCT02633059; fáza II – NCT03287245, NCT02624986, NCT02633059). Napríklad v prípade akútnej myeolidnej leukémie (AML) pacientov bola pozorovaná dobrá znášanlivosť liečby sprevádzaná klinickou odpoveďou aj ako monoterapie, ale aj v kombinácií s cytarabinom [96]. Idasanutlin sa dostal aj do klinických testov fáze III pre pacientov s AML v kombinácii s cytarabinom (NCT 02545283).

Mnohé ďalšie liečivá využívajú stratégiu blokovania p53 väzby s proteínom HDM2. Patria sem nízkomolekulárne látky z rady spiro-oxindolov ako MI-7730, imidazothiazolov ako DS-3032b, piperidinonov ako AMG232 a mnohé ďalšie [97]. Okrem nízkolmolekulárnych látok sa ako inhibítory HDM2 využívajú aj peptidy, ktoré mimikujú tri hlavné aminokyseliny p53 interagujúce s HDM2 (Phe19,Trp23,Leu26). Takýto peptid sa špecificky viaže do hydrofóbnej kapsy p53-väzbovej domény. Na rozdiel od malých molekúl ponúka možnosť blokovať nielen interakciu s HDM2, ale zároveň aj s HDMX [98,99]. Peptid s názvom ALRN-6924 vstúpil aj do klinických štúdií zameraných na solidné tumory, lymfómy a AML (NCT02909972, NCT02264613).

Iné prístupy aktivácie p53 dráhy skrz HMD2 a HDMX boli zatiaľ ukázané v predklinických štúdiách. Na blokovanie transkripcie génov boli popísané látky účinkujúce na expresiu HDM2 [100,101] alebo na HDMX [102]. Blokátory ubikvitinačnej aktivity proteínu HDM2 boli nájdené pomocou screeningu látok ubikvitinačným testom v bunkách a bol ukázaný ich synergistický efekt na apoptózu s DNA-poškodzujúcimi látkami [103]. Keďže HDM2 dimerizácia s HDMX stabilizuje proteín HDM2 a tým zvyšuje jeho účinnosť v ubikvitinácii p53, narušenie tejto interakcie pomocou mimikujúcich peptidov ponúka alternatívu k aktivácii signálnej dráhy p53 [104]. Schopnosť HDM2 viazať mRNA XIAP bola tiež využitá pri návrhu liečiv. HDM2 sa za normálnych podmienok viaže k mRNA XIAP, inhibítoru apoptózy, a zvyšuje jeho transláciu. Pôsobením látky MX69, ktorá blokuje interakciu HDM2 s mRNA XIAP, sa zníži hladina proteínu HDM2 a taktiež translácia proteínu XIAP, stabilizuje sa proteín p53 a dochádza k zástave bunkového cyklu [105].

Záver

Proteíny HDM2 a HDMX patria medzi onkogénne proteíny. V normálnych podmienkach sú dôležitými regulátormi hladiny proteínu p53, ale hrajú aj významnú úlohu v opravách poškodenej DNA. Pri nadmernej expresii HDM2 alebo HDMX dochádza k nadmernému blokovaniu odpovede skrz p53 signálnu dráhu, čo vedie k vzniku nádorov. Zvýšená hladina proteínov HDM2 a HDMX bola pozorovaná takmer u všetkých typoch nádorov a je spojovaná s inaktiváciou signálnej dráhy p53 v nádoroch, ktoré si zachovávajú wild type p53. Hladina proteínov HDM2 a HDMX je zvýšená najmä skrz génovú amplifikáciu, ale bol popísaný aj vplyv polymorfizmov jedného nukleotidu, príp. zmeny v regulácii transkripcie, posttranskripčných procesov, translácie a posttranslačných procesov. Výskum v oblasti štruktúry proteínov HDM2 a HDMX, ich interakcie s proteínom p53 a poznanie funkcie jednotlivých domén dovolil vzniknúť mnohým prístupom k ovplyvneniu p53 dráhy. Niektoré látky vstúpili do klinických štúdií fázy I, II a III a predstavujú sľubnú možnosť liečby určitých typov rakoviny, ako napr. AML.

Práca bola podporená projektom MŠMT – NPU I – LO1413.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Mgr. Lucia Hároníková, Ph.D.

Regionální centrum aplikované molekulární onkologie

Masarykův onkologický ústav

Žlutý kopec 7 656 53 Brno

e-mail: lucia.haronikova@mou.cz

Přijato: 16. 7. 2018