Detekcia mutácií v géne FLT3 u pacientov východoslovenského regiónu

Overview

Východisko:
Práca poukazuje na význam monitoringu mutácií v géne FLT3 aplikáciou jednoduchej metódy molekulovej genetiky.

Pacienti a metódy:
Súbor tvorilo 141 pacientov vo veku od 19 do 81 rokov s primárnou akútnou myeloblastovou leukémiou (AML) a 8 pacientov s prechodom myelodysplastického syndrómu (MDS) do AML. Metódou PCR bola analyzovaná DNA zo vzorky periférnej krvi a/alebo kostnej drene. Dôkaz internej tandemovej mutácie FLT3 génu (FLT3-ITD) je založený na amplifikácii exónov 14 a 15. Bodová mutácia v tyrozín kinázovej doméne FLT3 génu (FLT3-TKD) bola detegovaná restrikčnou analýzou PCR produktu exónu 20. Fragmenty boli separované elektroforeticky. PCR produkty pozitívnych vzoriek boli analyzované aj na mikročipe (Bioanalyzer 2100).

Výsledky:
Interná tandémová duplikácia FLT3-ITD bola potvrdená u 19 % pacientov a bodová mutácia FLT3-TKD u 8 %. Dvaja pacienti (1 %) mali obidve mutácie. Najväčšiu skupinu FLT3+ tvorili pacienti bez iných chromozómových aberácií (59 %) a pacienti s translokáciou t (15; 17) /PML-RARA (15 %). Úmrtnosť pacientov v skupine FLT3+ bola 33 % oproti 10 % v skupine FLT3–. V rámci FLT3+ skupiny bolo percento úmrtnosti takmer rovnaké u FLT3-ITD aj FLT3-TKD, paradoxne 77-ročná pacientka s dvojitou mutáciou FLT3-ITD/TKD bola v remisii. Ôsmich pacientov s prechodom MDS do AML sme posudzovali samostatne. U troch pacientov bola pri prechode do AML potvrdená FLT3 pozitivita, z toho u dvoch FLT3-ITD a u jedného FLT3-TKD. Iné génové aberácie z vyšetrovaného panelu u nich potvrdené neboli. Prežívanie týchto pacientov s FLT3+ bolo dlhšie ako u FLT3– pacientov. Výsledky dôkazu mutácií v géne FLT3 u pacientov východoslovenského regiónu korelujú s publikovanými výsledkami iných databáz.

Záver:
Aplikovaná PCR metóda je spoľahlivá, relatívne rýchla a finančne nenáročná, čo umožňuje rutinný monitoring mutácií v géne FLT3. Verifikácia FLT3 pozitivity na mikročipe je elegantnou náhradou analýzy na kapilárnej elektroforéze.

Klíčová slova:
akútna myeloblastová leukémia – DNA – PCR – mutácia – FLT3-ITD – FLT3-TKD

Úvod

Cytogenetika a molekulová genetika významne prispieva k diagnostike leukémií, pretože na podklade prítomnosti chromozómových aberácií definuje genetické markery, ktoré spolu s klinickými parametrami charakterizujú ochorenie a určujú jeho prognózu. Podľa prítomnosti rôznych genetických abnormalít sú pacienti stratifikovaní do prognostických skupín – priaznivá, intermediárna a nepriaznivá prognóza [1,2]. Dôkaz prítomnosti špecifických mutácií v génoch metódami molekulovej genetiky umožňuje monitorovať priebeh ochorenia a hodnotiť odpoveď na liečbu na molekulovej úrovni u pacientov bez štrukturálnych či numerických chromozómových aberácií. U pacientov s chromozómovými aberáciami má taktiež aj prognostický význam.

Jednou z mutácií, ktoré sa podieľajú na procese leukemogenézy, je mutácia v géne FLT3. Tento gén má dôležité postavenie v procese proliferácie, diferenciácie a prežívania prekurzorových krvotvorných buniek. Je lokalizovaný na 13. chromozóme (13q12.2), pozostáva z 24 exónov a pokrýva približne 96 kb. Gén FLT3 kóduje proteín s tyrozínkinázovou (TK) aktivitou triedy III. Tento receptor je zložený z extracelulárnej (tvorí ju päť N-glykozylovaných „imunoglobulín like“ slučiek) transmembránovej, juxtamembránovej a dvoch intracelulárnych TK domén [3]. Je exprimovaný prevažne na prekurzorových kmeňových bunkách v kostnej dreni [4,5]. FLT3 proteín je syntetizovaný ako monomér a po glykozylácii je umiestnený do cytoplazmatickej membrány. FLT3 môže reagovať s ligandom – proteín z triedy rastových faktorov, ktorý stimuluje proliferáciu hematopetických buniek. Po väzbe ligandu na imunoglobulínovú doménu receptora dôjde k dimerizácii, čo vedie ku konformačným zmenám v juxtamembránovej doméne a následnej autofosforylácii, čím sa aktivizuje TK, ktorá následne aktivizuje viaceré signálne intracelulárne dráhy (obr. 1).

V géne FLT3 sú známe dve špecifické mutácie – interná tandemová duplikácia (FLT3-ITD, viď nižšie) a bodová mutácia v TK doméne (FLT3-TKD). Interná tandemová duplikácia zahrňuje 3–400 bázových párov (bp) v exóne 14 a vedie k zmene proteínovej štuktúry v oblasti juxtamembránovej domény. Poškodenia juxtamembránovej domény môžu meniť jej dĺžku ako inzercie a delécie, preto niektorí autori ich nazývajú aj LM mutácie („lenght mutations“). Vo väčšine štúdií sú všetky mutácie postihujúce túto podjednotku označované ako FLT3-ITD mutácie [6]. Pri bodovej mutácii v aktivačnej slučke TK domény (FLT3-TKD) sa jedná o zámenu guanínu za tymín, čo spôsobí zámenu aspartátu (D) na kodóne 835 za tyrozín (Y) [7,8].

Mutácie v géne FLT3 spôsobia konštitutívnu aktiváciu receptora [9], a tak aj bez prítomnosti ligandu dôjde k dimerizácii, následným konformačným zmenám a autofosforylácii TK, výsledkom čoho je nekontrolovateľná proliferácia (obr. 1). Jedna z posledných štúdií tvrdí, že dĺžka a lokalizácia inzercie zásadne podmieňujú charakter internej tandémovej duplikácie a môžu potencovať fulminantnosť ochorenia už aj tak s nepriaznivou prognózou [10–12].

FLT3-ITD sa vyskytuje u 25–30 % pa-cientov s akútnou myeloidnou leukém-iou (AML) a FLT3-TKD u 7 % pacientov [13–15]. Existuje aj asociácia medzi FLT3-ITD a jednotlivými podtypmi AML podľa French-American-British (FAB) klasifikácie. Najčastejšie sa vyskytuje u pacientov s M3 AML [16]. Táto mutácia sa objavuje aj u 3 % pacientov s myelodisplastickým syndromom (MDS) a ojedinele aj u pacientov s chronickou myeloidnou leukémiou (CML). FLT3 mutácie neboli nájdené u pacientov s chronickou lymfocytovou leukémiou (CLL), mnohopočetným myelómom, non-Hodgkinovým lymfómom a samozrejme u zdravých jedincov [17,18]. U detí s AML je výskyt FLT3-ITD nižší a pohybuje sa okolo 15 %, pričom u FLT3-TKD je to 7 % podobne ako u dospelých [19]. Prítomnosť FLT3-ITD u pacientov s AML sa považuje za nepriaznivý prognostický faktor. U týchto pacientov bol zistený vyšší výskyt relapsov a prudký nárast leukemických blastov v periférnej krvi (PK) a kostnej dreni (KD), problematické je aj navodenie kompletnej remisie [20].

Cieľom práce bolo poukázať na význam monitoringu mutácií v géne FLT3 a možnosť aplikácie jednoduchej metódy molekulovej genetiky u pacientov s diagnózou AML de novo a u pacientov so sekundárnou AML, ktorá sa vyvinula z MDS.

Pacienti a metódy

Súbor pacientov

Dospelí pacienti Kliniky hematológie a onkohematológie UPJŠ LF a UNLP Košice – 141 pacientov (67 mužov a 74 žien) s diagnózou AML de novo, priemerný vek v čase diagnózy bol 54,7 rokov (19–81 rokov) a 8 pacientov (5 mužov a 3 ženy) s diagnózou sekundárna AML (MDS s prechodom do AML), priemerný vek 65,6 rokov (60–79 rokov). Analyzovaná bola vzorka PK a KD uvedených pacientov. Prezentované výsledky sú anonymné.

Izolácia DNA

Genómová DNA (gDNA) bola izolovaná zo vzorky PK a/alebo aspirátu KD podľa štandardného protokolu kitu QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) na automatickom robotizovanom zariadení Qiacube (Qiagen). Vzorka DNA bola buď hneď analyzovaná, alebo uskladnená pri –20 °C do následného spracovania.

Genetická analýza FLT3 génu a iných chromozómových aberácií

Dôkaz internej tandemovej duplikácie v géne FLT3 (FLT3-ITD) je založený na amplifikácii exónu 14 a 15 metódou polymerázové reťazovej reakcie (polymerase

chain reaction – PCR) [21]. PCR produkt nemutovaného génu má veľkosť 328 bp. Dlhšie fragmenty svedčia o prítomnosti FLT3-ITD. Detekcia mutácie v tyrozínkinázovej doméne (FLT3-TKD) je založená na restrikčnej analýze PCR produktu exónu 20, ktorý je substrátom restrikčnej endonukleázy EcoRV. EcoRV vertikálne štiepi DNA sekvenciu 5‘-GAT|ATC-3‘ a rozštiepi amplifikovaný fragment veľkosti 114 bp na 68 bp a 46 bp. V prípade bodovej mutácie je guanín (G) zamenený za tymín (T). EcoRV túto sekvenciu neštiepi a tak nerozštiepený fragment veľkosti 114 bp potvrdzuje prítomnosť mutácie. Ak je prítomný len fragment 114 bp, je mutácia prítomná v obidvoch alelách. Vo väčšine prípadov je mutovaná len jedna alela a výsledkom reakcie sú produkty 114, 68 a 46 bp (obr. 3B). Separácia produktov PCR bola realizovaná horizontálnou elektroforézou na 3% agaróze, vizualizácia UV svetlom. Fotodokumentácia z každej analýzy bola archivovaná. PCR produkty pozitívnych vzoriek boli analyzované aj mikročipovou elektroforézou na zariadení Bioanalyzer 2100 (Agilent). Metodický postup analýzy zvyšných chromozómových/genetických aberácií je uvedený inde [1].

Výsledky

Mutácie v géne FLT3 boli detegované jednoduchou a relatívne rýchlou PCR diagnostikou na základe elektroforetickej separácie a identifikácie veľkosti fragmentov (obr. 2). V prípade pozitivity na prítomnosť FLT3 mutácie bol PCR produkt verifikovaný aj separáciou na mikročipe Bioanalyzer 2100 (obr. 3), kde bola presne stanovená veľkosť fragmentu, ako aj pomer intenzity mutovanej a nemutovanej alely.

AML pacienti

Súbor tvorilo 141 dospelých pacientov, u ktorých bola diagnostikovaná AML de novo. Priemerný vek AML pacientov v čase diagnózy bol 54,7 rokov (19–81 rokov). Priemerný vek FLT3 negatívnych pacientiov (FLT3–) bol 54,3 rokov, skupina FLT3 pozitívnych pacientov (FLT3+) bola staršia, priemerný vek bol 59,1 rokov.

Pacienti s mutáciou v géne FLT3 tvoria 1/3 (28 %). Pomer mužov (48) a žien (54) v skupine bez FLT3 mutácie je pomer takmer rovnaký, u FLT3+ pacientov je žien (26) 2× viac ako mužov (13). FLT3-ITD bola potvrdená u 18 % pacientov a bodová mutácia FLT3-TKD v 8 % zo všetkých AML pacientov. Dvaja pacienti mali obidve mutácie. V jednom prípade sme potvrdili mutáciu FLT3-ITD v obidvoch alelách, rovnako aj mutáciu FLT3-TKD v obidvoch alelách sme zachytili u jedného pacienta. Obidvaja pacienti zomreli pár dní od potvrdenia diagnózy.

V rámci skupín FLT3+/– sme pacientov ďalej rozdelili podľa prítomnosti ďalších chromozómových aberácií – bez aberácií, trizómia chromozómu 8, PML-RARA, CBFB-MYH11, AML1-ETO, MLL, komplexný karyotyp. Percentuálne zastúpenie pacientov v jednotlivých špecifických podskupinách bolo takmer rovnaké u FLT3– aj u FLT3+, s výnimkou translokácie t (15; 17) /PML-RARA, kde u FLT3+ pacientov to bolo 15 oproti 7 % FLT3– a naopak, pacienti s komplexným karyotypom a viac ako dvoma ďalšími prítomnými genetickými aberáciami v skupine FLT3– tvorili 14 oproti 3 % v súbore FLT3+. V skupine FLT3+ pacientov sme nezachytili ani jednu translokáciu t (8; 21) /AML1-ETO.

Porovnávali sme úmrtnosť pacientov do 1 roka od stanovenia diagnózy. Mutácia v géne FLT3 predstavuje nepriaznivý prognostický faktor, čo sa potvrdilo aj vo vyššej úmrtnosti pacientov v skupine FLT3+ (33 %) oproti 10 % v skupine FLT3–. V skupine FLT3– bolo 57 pacientov (56 %) s normálnym karyotypom, z toho zomreli 3 pacienti, čo predstavuje 5 % pacientov s normálnym karyotypom a FLT3 negativitou. FLT3 pozitivitu a normálny karyotyp malo 23 pacientov (59 %), z toho 30 % pacientov (7 pacientov) zomrelo. Aj u pacientov s normálnym karyotypom, ktorí sú zaradení do skupiny s intermediárnou prognózou, sa potvrdil posun k horšej prognóze v prípade mutácie v géne FLT3.

V rámci FLT3+ skupiny bola vyššia úmrtnosť u pacientov s FLT3-ITD (9 pa-cientov) ako u pacientov s FLT3-TKD (3 pacienti), ale percentuálne zastúpenie úmrtí v rámci danej mutácie bolo takmer rovnaké (35, resp. 36 %). Jedna 77-ročná pacientka s dvojitou mutáciou FLT3-ITD-TKD bola paradoxne v remisii.

MDS pacienti s prechodom do AML

Pacientov s diagnózou MDS (8 pacientov), ktorí boli vyšetrení v súvislosti s prechodom MDS do AML, sme zaradili do samostatného súboru. Priemerný vek pacientov bol 65,6 rokov. Z piatich FLT3– pacientov s prechodom do AML traja zomreli do 6 mesiacov od potvrdenia prechodu do AML. Ostatní remisiu nedosiahli. U troch MDS pacientov bola pri prechode do AML potvrdená FLT3 pozitivita, z toho u dvoch (1 muž a 1 žena, obaja vo veku 60 rokov) FLT3-ITD a u jedného FLT3-TKD. U FLT3 + pacientov bola táto mutácia jedinou pozitívnou genetickou aberáciou z vyšetrovaného panelu. U ženy bola FLT3-ITD počas MDS diagnózy negatívna, pozitivita sa potvrdila až pri prechode do AML po 9 mesiacoch od monitorovania FLT3 počas diagnózy MDS. Pacientka po roku od prechodu do AML je v dispenzári. Druhý pacient – 60ročný muž, bol u nás vyšetrený prvýkrát až pri prechode MDS do AML a odvtedy až do úmrtia (po 16 mesiacoch) bol monitorovaný na FLT3-ITD-pozitivitu. Priebeh ochorenia tohto pacienta je zaznamenaný na obr. 4. Pre názornosť sú tu uvedené aj hodnoty CD34+, ktoré podobne ako ostatné hematologické parametre korelovali s prítomnosťou mutácie FLT3-ITD. Veľkosť fragmentu mutovanej alely bola identická pri 1. analýze aj pri relapse ochorenia (po 13,5 mesiacoch), no odlišný bol pomer medzi mutovanou a nemutovanou alelou. Pri nasledujúcom kontrolnom vyšetrení (po 16 mesiacoch) bol už aj pomer medzi obidvoma alelami rovnaký ako pri 1. analýze.

Diskusia

Mutácie v géne FLT3 u pacientov s AML patria k negatívnym prognostickým markerom a výrazne zvyšujú riziko relapsov a úmrtia, preto ich monitoring je už súčasťou základných molekulovo-genetických vyšetrovacích panelov. Výsledky dôkazu mutácií v géne FLT3 u pacientov východoslovenského regiónu s diagnózou AML de novo korelujú s publikovanými výsledkami štúdie nemeckých pacientov [21] napriek takmer rádovému rozdielu v počte pacientov (979 pacientov v uvedenej štúdii oproti 142 pacientov v aktuálnej štúdii) (tab. 1). Pre porovnanie výsledkov sme vybrali štúdiu, kde na dôkaz mutácií v géne FLT3 bola použitá rovnaká PCR metóda. Rozdiely vo výskyte translokácií t (15; 17) /PML-RARA a 16inv (16) (p13; q22) / t (16; 16) (p13; q22) //CBFB-MYH11 oproti databáze nemeckých pacientov sú spôsobené pravdepodobne malým počtom pacientov v našom súbore. U pacientov s translokáciou PML/RARA bol pomer medzi FLT3– a FLT3-ITD+ približne 1: 2 v obidvoch súboroch.

V súbore boli aj 2 pacientky (44 a 77 ro-kov) s obidvoma mutáciami. Predpokladá sa [22], že prítomnosť obidvoch mutácií zhoršuje prognózu. Napriek tomu 77-ročná pacientka s obidvoma mutáciami dosiahla remisiu. Materiál tejto pacientky bude podrobený ďalším analýzam za účelom zistenia presného typu bodovej mutácie, ako aj lokalizovania mutácií FLT3-ITD a FLT3-TKD na alelách, t. j. či sú mutácie na tej istej alebo rôznych alelách.

U všetkých pacientov sme vyšetrovali paralelne PK aj KD pri vstupnom vyšetrení aj pri monitorovaní účinku terapie. V obidvoch materiáloch boli mutácie identické a dobre detegovateľné. Len v jedinom prípade relapsu bola mutácia prítomná len vo vzorke KD, vzorka PK bola negatívna.

Typ a veľkosť FLT3-ITD mutácie boli pri vstupnom vyšetrení a relapse u všetkých monitorovaných pacientov rovnaké, teda jednalo sa o rovnaký klon.

Mutácie v géne FLT3 boli vyšetrované aj u MDS pacientov. Do štúdie sme vybrali len tých pacientov, u ktorých bol diagnostikovaný prechod do AML. Zaujímavosťou bolo, že pacienti bez FLT3 mutácie po prechode do AML zomreli do 6 mesiacov, zatiaľ čo pacient s FLT3-ITD prežil 16 mesiacov a druhá pacientka s FLT3-ITD zatiaľ prežíva viac ako rok. Tento fakt koreluje s publikovaným údajom [17], kde pacienti bez FLT3 mutácie prežívali kratšie (priemer 16 mesiacov) ako pacienti s mutáciou FLT3 (19 mesiacov). Vzhľadom na náš veľmi malý súbor sekundárnych AML pacientov nie je možné robiť podrobnejšie závery ani porovnávať údaje s literatúrou.

Na dôkaz mutácií v géne FLT3 sme aplikovali jednoduchú PCR metódu so separáciou fragmentov na klasickej agarózovej elektroforéze a verifikácii pozitivity na mikročipe na zariadení Bioanalyzer 2100, kde sme presne určili veľkosti fragmentov ako aj pomer medzi mutovanou a nemutovanou alelou v prípade FLT3-ITD. Táto metóda bola dostatočne citlivá na dôkaz mutácií. Nebol problém ani s amplifikáciou dlhších úsekov FLT3-ITD, kde je viditeľný vyšší podiel mutovanej alely, ktorá je dlhšia ako nemutovaný fragment s nižšou intenzitou.

Výber vhodnej metódy je dôležitý pre správne zachytenie nielen pozitivity, ale aj pomeru medzi mutovanou (FLT3-ITD) a nemutovanou alelou (wild type – WT) v súvislosti s prognózou a možnosťou skoršieho relapsu a celkovým prežívaním pacienta. Dlhšie fragmenty a vyšší pomer FLT3-ITD: WT zhoršujú prognózu ochorenia [23].

Záver

Výsledky analyzovaného súboru poukazujú na vhodne zvolenú PCR metódu, ktorá je relatívne rýchla a finančne nenáročná, čo umožňuje monitorovať mutácie v géne FLT3 nielen u pacientov s AML, ale rutinne aj u všetkých MDS a CMMoL (chronická myelomonocytová leukémia) pacientov. Aplikovaná metóda bola dostatočne citlivá na dôkaz mutácií a bezproblémovú amplifikáciu aj dlhších úsekov FLT3-ITD. Verifikácia FLT3 pozitivity na mikročipe nahrádza separáciu PCR produktu na kapilárnej elektroforéze, ktorá je finančne podstatne náročnejšia ako analýza na mikročipe.

V rutinnej klinickej praxi sú FLT3+ pacienti zatiaľ dilemou. Z dôvodu určenia prognózy v súčasnosti pre našich klinikov úplne stačí dôkaz FLT3 pozitivity a pravidelný monitoring tejto mutácie pri každej kontrole. Stanovenie pomeru FLT3-ITD: WT sa zatiaľ nevyžaduje. Monitoring MDS a CMMoL pacientov na prítomnosť FLT3 mutácií by mal byť súčasťou základného vyšetrovacieho panelu v rámci molekulovej genetiky, pretože objavenie sa FLT3 pozitivity u týchto pacientov je predzvesťou prechodu do AML.

Vzhľadom na vývoj inhibítorov FLT3– tyrozínkinázy v súvislosti s liečbou FLT3+ pacientov sa uvažuje aj o zavedení štandardného postupu pri monitorovaní minimálneho reziduálneho ochorenia (minimal residual disease – MRD) na základe kvantifikácie FLT3-ITD (podobne ako u CML monitoring fúzneho génu BCR/ABL). V mnohých prípadoch je mutácia v géne FLT3 jediný pozitívny genetický marker u AML pacientov.

Poďakovanie

Vďaka za spoluprácu patrí Mgr. Ivete Lučkovej a RNDr. Františkovi Spišákovi, PhD.

Táto práca bola podporená grantom z Európského fondu regionálneho rozvoja OPVaV- -2009/2.2/05-SORO (ITMS kód: 26220220143).

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

doc. Ing. Katarína Dubayová, PhD.

Ústav lekárskej a klinickej biochémie UPJŠ LF Košice

Trieda SNP 1 040 11 Košice

e-mail: sembid.vyskum@gmail.com

Obdržané: 19. 10. 2017

Prijaté: 15. 2. 2018