Profil aktivace receptorových tyrozinkináz a mitogenem aktivovaných proteinkináz v terapii Maffucciho syndromu

Overview

Východiska:
Maffucciho syndrom je vzácné kongenitální nehereditární onemocnění charakterizované přítomností mnohočetných hemangiomů a enchondromů s tendencí k malignímu zvratu. Kauzální terapie neexistuje a léčba je zaměřena na řešení komplikací. Stanovení vhodného postupu je komplikované a často je nutná multioborová spolupráce v péči o tyto pacienty.

Případ:
Autoři prezentují případ 20leté pacientky s Maffucciho syndromem. V průběhu života se u ní objevily mnohočetné enchondromy i progredující hemangiomy, které postupem času působily řadu komplikací jako např. omezení hybnosti, poruchy růstu, bolesti, fluidothorax nebo ascites. Byl vyšetřen profil fosforylace vybraných tyrozinových kináz a MAP kináz z progredujících ložisek hemangiomů, což vedlo ke změně léčebné strategie reflektující výsledky vyšetření. Personalizovaná léčba nasazená na základě profilu fosforylace kináz vedla ke klinicky významné léčebné odpovědi trvající šest měsíců.

Klíčová slova:
enchondromatóza – hemangiom – protein-tyrozinkinázy – MAP kinázový signální systém – individualizovaná medicína – Maffucciho syndrom

Úvod

Maffucciho syndrom je vzácné kongenitální nehereditární onemocnění, které patří spolu s Ollierovou chorobou mezi enchondromatózy. Toto onemocnění je charakterizováno přítomností četných hemangiomů a enchondromů, které mají tendenci k malignímu zvratu až u 40 % pa­cientů [1]. Standardní léčebná doporučení, která by ovlivňovala přirozený průběh vzniku a progrese mnohočetných enchondromů a hemangiomů, nejsou k dispozici a doporučuje se jen symp­tomatická a podpůrná léčba [2,3].

Případ

Dvacetiletá mladá žena byla sledována již od kojeneckého věku pro přítomnost mnohočetných enchondromů na končetinách, genua vara a poruchu kostního růstu s těžkou růstovou retardací. Její stav vyžadoval opakované korekční ortopedické výkony. Ve dvou letech věku se u ní objevil myelodysplastický syndrom, který se následně rozvinul do RAEB (refractory anemia with excess blasts) s nutností terapie dle protokolu pro akutní myeloidní leukemii zahrnující i alogenní transplantaci kostní dřeně.

Ve věku šesti let se u ní začaly objevovat postupně progredující hemangiomy na rukou (obr. 1), proto bylo při podezření na Maffucciho syndrom provedeno celkové přešetření. Výsledky potvrdily přítomnost chondromu/ enchondromu pravé sfenoidální kosti o velikosti 3,4 × 2,5 × 1,7 cm. V rámci základní nemoci docházelo k postupné progresi histologicky vřetenobuněčných hemangiomů na pažích a vzniku nových lézí na nohou i v parenchymových orgánech, proto bylo tři roky po transplantaci kostní dřeně doporučeno zahájit léčbu nízce dávkovanou chemoterapií. Byla zvolena terapie vincristin 1,5 mg/ m²/ týden + cyklofosfamid 300 mg/ m²/ à 3 týdny, avšak vzhledem ke špatné toleranci již vysoce předléčené pa­cientky bylo nutné tuto léčbu po šesti měsících přerušit.

Stav se postupně dále zhoršoval, objevilo se nové ložisko hemangiomu na játrech 4,8 × 3,8 cm a další ložiska na hrudníku a horních končetinách. Proběhl pokus o ovlivnění těchto ložisek kortikoterapií, a to metylprednisolonem 30 mg/ kg/ den D1, D3 a D5, 20 mg/ kg/ den D6 a v dávce 10 mg/ kg/ den D7 a dále navázáno prednizonem 4 mg/ kg/ den po 2 týdny [4]. Výsledkem této terapie byla v nejlepším případě smíšená odpověď. V průběhu léčby proběhly pokusy o ovlivnění ložisek zářením, laserem i chirurgickými korekcemi.

Od 18 let se pa­cientka potýkala s opakovaným chylózním fluidothoraxem a přítomností chylózní ascitické tekutiny v důsledku aktivity hemangiomů. Tento stav vyžadoval opakované punkce ascitu, v průměru 2 l ascitické tekutiny každé dva týdny. Byl nasazen bevacizumab 10 mg/ kg/ à 2 týdny, po osmi měsících terapie bylo dosaženo pouze stacionárního stavu s pokračující potřebou punkcí ascitu i fluidothoraxu. V této době byla změněna léčba na sirolimus 1 mg/ den a paclitaxel 12,5 mg/ m²// à 1 týden [5]. Tato terapie byla podávána šest měsíců s nutností redukce paclitaxelu na 50 % dávky pro hematologickou toxicitu. Výsledek byl pouze stacionární stav.

Nově byl vyšetřen profil fosforylace receptorových tyrozinkináz (RTK) a MAP kináz (mitogen‑activated protein kinases) z ložiska na patě a dle těchto výsledků byla terapie upravena na sunitinib 12,5 mg/ den a taxol 5,5 mg/ týden. Mimo těchto léků měla dívka v dlouhodobé medikaci také β‑blokátory z kardiologické indikace, u nichž ně­kte­ré práce poukazují na jejich antineoplastický potenciál [6]. Po nasazení této personalizované terapie došlo postupně k prodlužování intervalů pro evakuace ascitu či chylothoraxu, s periodou čtyř měsíců bez potřeby evakuace, což mělo významný dopad na kvalitu života pa­cientky. Po čtyřech měsících od poslední evakuace ascitu se i přes nasazenou léčbu obnovila potřeba evakuace chylothoraxu s potřebou opakovaných chirurgických intervencí a tedy i s přerušováním, až vysazením antineoplastické medikace na dobu téměř tří měsíců. V průběhu významně redukované či vysazené antineoplastické léčby progredovala potřeba chirurgické derivace chylu charakteru jahodového mléka. Pa­cientka zemřela náhlou smrtí na akutní krvácení do dutiny břišní v důsledku spontánní ruptury jaterního hemangioendotheliomu tři měsíce po deeskalaci antineoplastické terapie, devět měsíců po zahájení personalizované terapie.

Metodika a výsledky

Pro detekci fosforylace RTK byl použit Human Phospho‑ RTK Array Kit (R&D Systems) umožňující současné stanovení fosforylace 49 kináz z 16 receptorových rodin, přičemž u člověka bylo zatím popsáno 58 RTK rozdělených do 20 rodin v závislosti na podobnosti proteinové struktury receptorů [7]. Princip metody detekce spočívá v nanesení proteinového lyzátu na nitrocelulózovou membránu, na níž jsou ve dvojicích bodů imobilizovány specifické protilátky proti dané kináze. Fosforylované i nefosforylované formy proteinu se na protilátku naváží v ekvimolárním poměru a v následujícím kroku jsou pouze fosforylované formy proteinu označeny protilátkou proti fosforylovanému tyrozinu konjugovanou s peroxidázou. Po aplikaci chemiluminiscenčního substrátu na membránu lze luminiscenci detekovat na filmu nebo pomocí chemiluminiscenčního skeneru.

Fosforylační status MAP kináz a vybraných serin/ treoninových kináz a dalších signálních molekul byl analyzován pomocí Human Phospho‑ MAPK Array Kit (R&D Systems) umožňující současné stanovení fosforylace 26 kináz včetně zástupců tří hlavních rodin (ERK, JNK a p38). Princip metody je podobný jako v předchozím v případě, s tou výjimkou, že pro odlišení fosforylovaných a nefosforylovaných forem kináz je použito specifických protilátek přímo proti fosforylovaným formám kináz konjugovaných s bio­tinem. Na bio­tin se následně naváže streptavidin konjugovaný s peroxidázou, jež aktivuje chemiluminiscenční substrát.

Zmražený vzorek tkáně byl rozdělen na dvě části a lyzáty pro obě analýzy byly připraveny dle pokynů výrobce, následně bylo použito 300 µg celkového proteinu pro každou z analýz. Míra fosforylace jednotlivých proteinů byla denzitometricky kvantifikována softwarem ImageJ, z duplikátů byl vypočítán průměr a od něj odečtena hodnota pozadí. Data byla normalizována vztažením k maximální hodnotě dosažené na každé z použitých membrán.

Fosforylace RTK byla výrazná především u receptoru pro epidermální růstový faktor (EGFR), inzulinového receptoru (InsR) a obou variant receptoru pro růstový faktor krevních destiček (platelet derived growth factor –  PDGFRα a PRGFRβ) (graf 1A, C).

V rámci analýzy fosforylace MAP kináz byla zaznamenána vysoká míra fosforylace ERK1 a ERK2 a částečně i kinázy p38γ. Dále byla aktivována kináza Akt  2, jež patří do rodiny nejvýznamnějších signálních molekul serin/ treoninových kináz Akt. Jedním z nejvíce fosforylovaných proteinů, jenž může být fosforylačním cílem v případě aktivace kináz rodiny p38 [8], byl HSP27 (graf 1B, D).

Diskuze

Maffucciho syndrom patří mezi velmi vzácná onemocnění a manifestuje se v 78 % před začátkem puberty [9]. Je charakterizován přítomností enchondromů, mnohočetných hemangiomů a vzácně také lymfangiomů. Standardní terapie neexistuje a výběr vhodné strategie může být velmi svízelný. Enchondromy vznikají nejčastěji v oblasti dlouhých kostí dolních končetin, nohy a ruky [9]. V případě, že omezují funkčnost končetiny, ovlivňují normální růst nebo působí bolest, je přistoupeno k chirurgickému řešení. Hemangiomy jsou benigní cévní tumory, které mohou vznikat prakticky kdekoliv v těle, v rámci tohoto onemocnění mohou postupně progredovat a výrazně omezovat kvalitu života postiženého jedince. V literatuře jsou popsány případy, u nichž bylo úspěšně využito antiangiogenní terapie k ovlivnění hemangiomů u těchto pa­cientů [5].

V případě této pa­cientky bylo těžké vybrat vhodnou léčebnou strategii, mimo jiné především z důvodu komorbidit a rozsahu jejího onemocnění. Bylo vyzkoušeno několik, dříve v literatuře popsaných, léčebných modalit, avšak výsledky léčby byly dosti nepřesvědčivé. V rámci snahy nalézt vhodný terapeutický cíl na úrovni proteinů, který by odrážel skutečnou aktivitu v patologických buňkách, byl vyšetřen profil fosforylace RTK a navazujících signálních drah. Tato dia­gnostická metoda se jeví jako slibný prostředek, který by mohl umožnit podávání cílené bio­logické léčby pa­cientům s prokázanou aktivací signální dráhy na úrovni proteinů. Tento postup by v konečném důsledku mohl zlepšit výsledky léčby, snížit množství komplikací a celkově snížit náklady na léčbu vlastního onemocnění, které mohou být při empirickém podávání takovýchto léků dosti vysoké.

Na základě výsledků naší analýzy byl do léčebného schématu přidán sunitinib v kombinaci s paclitaxelem. Sunitinib je multikinázový inhibitor, který cílí především proti receptoru pro růstový faktor krevních destiček (PDGFR) a proti receptoru pro cévní endoteliální růstový faktor (vascular endothelial growth factor –  VEGFR), čímž ovlivňuje angiogenezi a buněčnou proliferaci. FDA (Food and Drug Administration –  Úřad pro kontrolu léčiv) jej oficiálně schválila k léčbě GIST, renálního karcinomu a neuroendokrinních tumorů pankreatu, avšak pro silný antiangiogenní potenciál byl výhodný i pro naše účely. Paclitaxel je alkaloid, který blokuje depolymerizaci mikrotubulů dělícího vřeténka a je používán pro léčbu řady malignit. Při metronomickém dávkování a v kombinaci s dalšími léky prokázal významný antiangiogenní potenciál [10]. Prezentovaná kazuistika dokumentuje obtížnost péče o pa­cienty s Maffucciho syndromem, kdy interpretace klinického průběhu posledních týdnů a vysvětlení úmrtí pa­cientky zůstává spekulativní.

Závěr

Terapie vzácných onemocnění je nesnadná. Neexistují ověřené postupy a většina poznatků o takových stavech je známa pouze z kazuistik. Velké randomizované klinické studie fáze III zde nikdy nebudou k dispozici, přestože je systém registrací a úhrad zdravotních pojišťoven vyžaduje i v těchto případech. Vyšetření signálních drah aktivovaných RTK by mohlo do budoucna přispět k sestavování individualizované léčby tam, kde standardní léčba není známa anebo není dostatečně účinná, jako jsou vzácná, refrakterní nebo ně­kte­rá pokročilá nádorová onemocnění dětského věku. Vytváření a následná realizace personalizovaných léčebných postupů vyžadují komplexní, multioborovou spolupráci a pečlivé vyvažovaní rizik a event. přínosů takových postupů.

Práce byla podpořena Evropským fondem pro regionální rozvoj a státním rozpočtem České republiky OP VaVpI – RECAMO, CZ.1.05/2.1.00/03.0101, projektem CEB, OPVK CZ.1.07/2.3.00/20.0183 a projektem MUNI//A/1552/2014.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

MUDr. Kristýna Melichárková

Klinika dětské onkologie

LF MU a FN Brno

Černopolní 9

613 00 Brno

e-mail: kristyna.melicharkova@fnbrno.cz

Obdrženo: 18. 4. 2015

Přijato: 26. 6. 2015