Molekulární patofyziologie ribozomopatií – onemocnění s narušenou funkcí ribozomů

Souhrn

Ribozomy jsou buněčné struktury zodpovědné za syntézu proteinů. Utvářejí se během složitého procesu, který se nazývá biogeneze ribozomů. Vrozené ribozomopatie jsou heterogenní skupinou onemocnění, jejichž příčinou jsou genetické abnormality způsobující narušení biogeneze a funkce ribozomů. Mutovány mohou být geny ribozomálních proteinů i dalších faktorů podílejících se na ribozomální biogenezi. Charakteristickým znakem vrozených ribozomopatií jsou tkáňově specifická poškození a zvýšené riziko rozvoje nádorových onemocnění. Nedávný výzkum navíc odhalil, že klinicky významné jsou i somatické mutace v genech pro ribozomální proteiny, jelikož se podílejí na procesu nádorové transformace. V tomto souhrnném článku je popsáno patofyziologické působení ribozomálních defektů na buněčné a molekulární úrovni i možné mechanizmy podporující onkogenezi. Článek dále pojednává o léčbě ribozomopatií a představuje nové terapeutické možnosti.

Klíčová slova:

: ribozomopatie – biogeneze ribozomů – translace – Diamondova-Blackfanova anémie

ÚVOD

Ribozomy jsou složité ribonukleoproteinové struktury, které v buňkách plní esenciální úlohu v procesu translace zabezpečujícím syntézu proteinů. Pro proteosyntézu ribozomy využívají molekuly mediátorové RNA (mRNA), jejichž nukleotidovou sekvenci prostřednictvím transferové RNA (tRNA) překládají podle pravidel genetického kódu do aminokyselinové sekvence proteinu. Proces tvorby samotných ribozomů zvaný biogeneze ribozomů je jedním z nejrozmanitějších a energeticky nejnáročnějších procesů v buňce. Ribozomopatie jsou nedávno ustavenou skupinou onemocnění, která je charakterizována narušenou biogenezí ribozomů a jejich dysfunkcí. První odhalenou ribozomopatií byla Diamondova-Blackfanova anémie (DBA). Toto vzácné onemocnění, patřící do skupiny vrozených syndromů selhání kostní dřeně, bylo popsáno již v roce 1938, avšak k odhalení jeho genetické podstaty došlo teprve na sklonku 20. století. V roce 1999 Draptchinskaia et al. popsali u pacientů s DBA rekurentní heterozygotní mutaci v genu RPS19, který kóduje ribozomální protein (RP) S19 [1]. RPS19 je integrální součástí malé ribozomální podjednotky a mutace jeho genu byla identifikována přibližně u 25 % pacientů postižených DBA. Později byly u DBA pacientů objeveny kauzální mutace i v dalších genech kódujících jiné ribozomální proteiny (RPs). Tento pozoruhodný nález vedl k poměrně neočekávanému zjištění, že za fenotyp DBA zodpovídají mutace, které vedou k narušení samotné biogeneze ribozomů. V následujících letech byly odhaleny další mutace způsobující poruchy v ribozomální biogenezi i u jiných vzácných vrozených syndromů, což vedlo k definování zcela nové skupiny onemocnění zvaných RIBOZOMOPATIE. Syndromy zahrnuté mezi ribozomopatie jsou klinicky různorodé. Existují ovšem dvě významné charakteristiky společné pro většinu těchto onemocnění. První spočívá ve zvýšené citlivosti některých tkání k narušení ribozomální biogeneze. Charakteristickým příkladem takové tkáně je kostní dřeň, jejíž selhání doprovází většinu ribozomopatií. Druhým společným rysem je pak významné zvýšení náchylnosti postižených pacientů k rozvoji nádorových onemocnění. Přestože byl termín ribozomopatie původně zaveden pouze pro označení syndromů způsobených vrozenými (germinálními) mutacemi, nové poznatky nádorové biologie poukazují na výrazný podíl a kauzální charakter obdobných získaných (somatických) mutací u řady nádorů. Tyto nálezy tak vedly k rozšíření celé problematiky ribozomopatií i o tzv. somatické ribozomopatie, které vznikají až během života [2].

Ribozomy a jejich biogeneze

Eukaryotické ribozomy se skládají z malé 40S a velké 60S ribozomální podjednotky. Nacházejí se volně v cytoplazmě nebo jako součást endoplazmatického retikula. U člověka je malá ribozomální podjednotka tvořena 18S ribozomální RNA (rRNA) a 33 RPs a velká podjednotka je tvořena třemi rRNA (28S, 5S a 5.8S) a 47 RPs. Biogeneze ribozomů je několikastupňový, komplexní a koordinovaný proces, který z velké části probíhá v jadérku a jehož výsledkem je tvorba funkčních ribozomů v cytoplazmě (obr. 1). Jednotlivé kroky zahrnují tvorbu zralých rRNA, syntézu jednotlivých RPs, jejich asociaci do 90S pre-ribozomu, který se rozdělí na nezralé 40S a 60S ribozomální podjednotky vstupující do cytoplazmy, kde následně asociují za vzniku funkčního ribozomu. K narušení biogeneze ribozomů může docházet na všech úrovních tohoto komplexního procesu, od počáteční transkripce rRNA až po závěrečné maturační kroky v cytoplazmě, a to v důsledku mutací v genech pro RPs, rRNA nebo genech kódujících tzv. zrací faktory jako např. treacle, dyskerin nebo TSR2 (obr. 1).

VROZENÉ RIBOZOMOPATIE

Vrozené ribozomopatie zahrnují heterogenní skupinu geneticky podmíněných syndromů, které jsou způsobeny germinálními mutacemi narušujícími některý z kroků ribozomální biogeneze. První syndromy zařazené mezi vrozené ribozomopatie byly DBA a X-vázaná dyskeratosis congenita (DC). Následně se seznam ribozomopatií rychle rozšířil o další syndromy. Mezi nejvíce studované patří vedle DBA Shwachmanův-Diamondův syndrom (SDS), syndrom hypoplastických chrupavek a vlasů (cartilage hair hypoplasia – CHH) a Treacherův-Collinsův syndrom (TCS) [3].

Diamondova-Blackfanova anémie

DBA je vzácná vrozená a obvykle závažná makrocytární anémie, která je způsobená izolovanou hypo- nebo aplázií erytropoézy v kostní dřeni. Prevalence onemocnění se pohybuje mezi 1: 100 000 a 1: 200 000. Kromě anémie se u více než poloviny pacientů vyskytují různé malformace hlavy a obličeje, palců horních končetin i některých vnitřních orgánů (srdce, ledviny, urogenitální trakt). Onemocnění je také spojeno se zvýšeným rizikem rozvoje hematologických malignit i solidních tumorů. Výrazná predispozice byla pozorována především k rozvoji myelodysplastických neoplázií (MDS), akutní myeloidní leukemie (AML), karcinomu tlustého střeva a osteogenního sarkomu [4]. Léčba je v prvním roce života realizována podáváním transfuzí erytrocytů. Po prvním roce se nasazují kortikosteroidy, na které přibližně 80 % pacientů reaguje akcelerací erytropoézy a zlepšením krevního obrazu. Přibližně 40 % pacientů může být následně dlouhodobě udržováno v režimu nízkých dávek steroidů a ve 20 % případů dokonce dochází k remisi onemocnění bez nutnosti dalších terapeutických intervencí. U pacientů, kteří jsou rezistentní na léčbu steroidy a jsou trvale závislí na transfuzích, připadá v úvahu transplantace hematopoetických kmenových buněk (hematopoietic stem cell – HSC) [5].

Hlavní genetickou příčinou DBA jsou mutace v genech kódujících RPs, které jsou identifikovány u více než poloviny pacientů. K dnešnímu dni byly nalezeny mutace v 20 různých genech kódujících proteiny velké nebo malé ribozomální podjednotky. Mutace vykazují autozomálně dominantní typ dědičnosti, přičemž se předpokládá, že homozygotní mutace RP genů jsou letální. V důsledku heterozygotních mutací pak dochází k tzv. haploinsuficienci příslušného proteinu, což má za následek narušené dozrávání rRNA a následné poruchy v biogenezi ribozomů. Kromě mutací v RP genech byly ve spojení s fenotypem podobným DBA identifikovány vzácné kauzální mutace i v genech GATA1 a TSR2 nacházejících se na chromozomu X a autozomálně recesivní mutace v genech pro erytropoetin (EPO) a enzym adenosindeaminázu 2 (ADA2). Gen GATA1 kóduje klíčový transkripční faktor erytroidní diferenciace, který hraje pravděpodobně stěžejní úlohu v samotné patofyziologii DBA. K výraznému snížení jeho exprese totiž dochází i ve spojení s mutacemi v RP genech [6,7]. Gen TSR2 kóduje maturační faktor ribozomální biogeneze [8]. EPO je peptidický hormon, který plní klíčovou roli v regulaci erytropoézy, a ADA2 je extracelulární enzym, který rozkládá adenosin a u něhož se předpokládá, že by mohl hrát důležitou roli v regulaci zánětu působením na růst a vývoj buněk imunitního systému. Bialelické mutace v genech EPO a ADA2 vedly u pacientů k erytroblastopenii podobné jako u DBA [9,10]. Na druhou stranu s výjimkou mutace v genu TSR2 nejsou mutace v ostatních nově popsaných genech spojeny s charakteristickým defektem v dozrávání rRNA. Evropské konsorcium pro DBA (EuroDBA) v roce 2017 stanovilo, že všechny geneticky podmíněné erytroblastopenie budou spadat pod označení DBA syndromy a označení klasická DBA bude vyhrazeno pouze pro erytroblastopenie spojené s defektem v biogenezi ribozomů (mutace RP, TSR2). Erytroblastopenie spojené s mutacemi EPO a ADA2 pak nově spadají do podskupiny označované jako „DBA-like“. U erytroblastopenií spojených s mutacemi v GATA1 byly navíc pozorovány znaky dyserytropoézy, abnormální megakaryopoézy a neutropenie, což naznačuje, že se jedná o samostatnou specifickou podskupinu DBA syndromu. Zhruba v 20 % případů DBA zůstává genetická příčina onemocnění stále neobjasněná [11].

Dyskeratosis congenita

DC je velmi vzácné onemocnění vyznačující se velkou genetickou i klinickou heterogenitou. Vzhledem k vzácnosti onemocnění nebyla jeho přesná prevalence dosud stanovena, ale odhaduje se, že muži jsou postiženi přibližně desetkrát častěji než ženy. Onemocnění se vyznačuje klasickou triádou mukokutánních abnormalit zahrnujících nepravidelnou pigmentaci kůže, slizniční leukoplakii a dystrofii nehtů. U více než 90 % pacientů dochází k selhání kostní dřeně, které zpravidla vede k pancytopenii [12]. Podobně jako v případě jiných syndromů selhání kostní dřeně je i v případě DC zvýšené riziko rozvoje maligních onemocnění, nejčastěji se jedná o spinocelulární karcinomy hlavy a krku, anorektální karcinom a leukemie. Onemocnění je také spojeno s vysokým rizikem rozvoje plicní fibrózy [13]. Podobně jako u DBA se cytopenie u DC léčí krevními transfuzemi a v případě progresivního selhání kostní dřeně s trvalou závislostí na transfuzích se nabízí transplantace HSC. Vzhledem k vysoké pleiotropii onemocnění vyžaduje péče o pacienty multioborovou spolupráci.

Společným rysem kauzálních mutací u DC je výskyt v genech, které se podílejí na integritě koncových části chromozomů tzv. telomer. Z tohoto důvodu se tento syndrom řadí do nové skupiny onemocnění zvané telomeropatie a za hlavní molekulární mechanizmus vzniku a rozvoje onemocnění je považováno progresivní zkracování telomer. V případě X-vázané DC, která je spojená s mutací v genu DKC1, se předpokládá, že k patologii onemocnění významně přispívá i narušení biogeneze ribozomů [14]. Gen DKC1 totiž kóduje multifunkční protein dyskerin, který je nejen součástí telomerázového komplexu, ale podílí se i na modifikaci (tzv. pseudouridylaci) rRNA (obr. 1) [15].

Shwachmanův-Diamondův syndrom

SDS je vzácné pleiotropní autozomálně recesivní onemocnění s prevalencí 1: 75 000. SDS je charakterizovaný především exokrinní pankreatickou insuficiencí a významnou poruchou krvetvorby, vedoucí většinou k chronické, či intermitentní neutropenii. Velmi často se přidružují i anémie a trombocytopenie. Mezi další klinické příznaky patří kosterní abnormality, poruchy jater, srdce a imunitního systému. Pacienti mají též silnou predispozici k rozvoji MDS a AML. Multisystémové onemocnění vyžaduje léčebný režim navržený specialisty z oborů gastroenterologie a hematologie. Pacientům se perorálně podávají pankreatické enzymy a vitamíny se současnou léčbou cytopenie pomocí transfuzí. V případech těžké neutropenie a infekcí se podává faktor stimulující kolonie granulocytů (G-CSF) a antibiotická profylaxe [16]. Dlouhodobá léčba vysokými dávkami G-CSF u pacientů s vrozenými neutropeniemi, vč. SDS, je asociována se zvýšeným rizikem transformace do MDS/AML [17]. Proto se v jejím průběhu doporučuje pravidelné vyšetřování kostní dřeně. Pokud se rozvine selhání kostní dřeně nebo dojde k transformaci do myeloidní malignity, je možné indikovat transplantaci HSC [16].

V roce 2003 byla objevena kauzální mutace v genu SBDS, která je identifikovaná až u 90 % pacientů s klinickými příznaky SDS [18]. Gen SBDS kóduje maturační faktor ribozomální biogeneze zvaný Shwachman-Bodian-Diamond syndrome (SBDS), který svým působením umožňuje spojení 40S a 60S ribozomálních podjednotek do funkčního 80S ribozomu (obr. 1). Další vzácné kauzální mutace spojené s SDS byly nalezeny v genech EFL1, SRP54 a DNAJC21, které se podílejí na biogenezi a/nebo translaci proteinů. Nicméně jejich podíl na SDS nepřesahuje ani 1 % případů, a tak přibližně v 10 % případů SDS zůstává genetická příčina onemocnění stále neobjasněna [19].

Syndrom hypoplastických chrupavek a vlasů

CHH je vzácné autozomálně recesivní onemocnění, které se charakteristicky vyskytuje především v komunitě amišů s prevalencí 1: 1 340. Poměrně vysoká prevalence CHH, 1: 20 000, se týká i lidí původem z Finska, avšak mimo uvedené populace se s tímto onemocněním setkáváme velmi zřídka [20]. Klinicky se CHH projevuje jako forma nanismu s krátkými končetinami a hypoplazií vlasů a ochlupení. Nemoc také doprovází mírná až těžká imunodeficience, která je výsledkem neutropenie a lymfopenie. Rovněž bylo prokázáno zvýšené riziko rozvoje několika malignit, především non-hodgkinových lymfomů [21]. Podobně jako u SDS lze chronickou neutropenii řešit podáváním G-CSF a těžkou imunodeficienci transplantací HSC.

V roce 2001 byla identifikována kauzální mutace v genu RMRP, jehož produktem je nekódující RNA. Tato RNA se spolu s dalšími proteiny podílí na vzniku multifunkčního komplexu, který má esenciální úlohu při sestřihu a dozrávání rRNA v jadérku [22,23] (obr. 1).

Treacherův-Collinsův syndrom

TCS je autozomálně dominantní onemocnění s incidencí 1: 50 000. Onemocnění vzniká během časného embryonálního vývoje jako důsledek abnormální proliferace buněk neurální lišty a hlavním klinickým příznakem je kraniofaciální dysmorfie daná hypoplazií obličejových kostí. Dále se mohou vyskytovat deformace uší spojené s nedoslýchavostí a eventuálně úplnou hluchotou, rozštěp patra, nesprávné zarovnání zubů a šikmé oči. Péče o pacienty vyžaduje spolupráci odborníků z oborů otorhinolaryngologie, oftalmologie, ortodoncie a logopedie, přičemž závažné kraniofaciální deformity vyžadují chirurgickou rekonstrukci. Na rozdíl od ostatních výše zmíněných ribozomopatií TCS není spojen s poruchou krvetvorby ani s predispozicí k rozvoji nádorových onemocnění.

V roce 1996 byla genetická příčina TCS spojena s mutacemi v genu TCOF1. Tento gen kóduje jadérkový protein treacle, který reguluje činnost RNA polymerázy I, a má tedy vliv na průběh transkripce genů kódujících rRNA (obr. 1). Zařazení TCS mezi ribozomopatie způsobené deregulací transkripce rRNA byla podpořena i nalezením kauzálních mutací v genu kódujícím podjednotku RNA polymerázy I [24].

SOMATICKÉ RIBOZOMOPATIE

Somatické ribozomopatie zahrnují širokou škálu nádorů se získanými mutacemi v genech interferujícími s biogenezí ribozomů. Především jde o geny pro RPs, nejčastěji mutovaným je gen pro RPL5 (tab. 1). I když se somatické mutace v genech pro RPs většinou odlišují od zárodečných mutací spojených s DBA, jde zpravidla rovněž o heterozygotní ztrátové mutace, v jejichž důsledku dochází k haploinsuficienci příslušného proteinu. V případě nádorových onemocnění se nepředpokládá, že by genetické změny v RPs byly samy o sobě dostatečné pro vznik nádoru. Rekurentní výskyt těchto mutací napříč různými nádorovými onemocněními i experimenty na zvířecích modelech ovšem naznačují jejich onkogenní potenciál v procesu nádorové transformace [25,26].

MDS-5q

Nejlépe charakterizovanou somatickou ribozomopatií je 5q-syndrom, který je považovaný za subtyp MDS a dle aktuální WHO klasifikace hematolymfoidních tumorů je nově označovaný jako MDS s nízkým počtem blastů a izolovanou delecí 5q (MDS-5q) [27]. Poprvé byl popsán v roce 1974 u pacientů s refrakterní anémií, u nichž se vyskytoval cytogenetický nález intersticiální delece dlouhého raménka chromozomu 5. Vyznačuje se makrocytární anémií, která je často doprovázena trombocytózou. V porovnání s jinými subtypy MDS mají pacienti s MDS-5q lepší prognózu a relativně nízkou míru progrese do AML, přičemž narušená erytropoéza pacientů poměrně dobře odpovídá na léčbu lenalidomidem. Nicméně přítomnost dalších somatických mutací v RUNX1, TET2, ale zejména v TP53, který kóduje tumorový supresor p53, je spojena s negativní prognózou a progresí onemocnění [28]. Deletovaná oblast u MDS-5q zahrnuje několik genů, avšak hlavní vliv na rozvoj onemocnění má ztráta genu RPS14. Heterozygotní ztráta tohoto genu vede podobně jako u DBA k haploinsuficienci RPS14 s následnými poruchami v ribozomální biogenezi.

MOLEKULÁRNÍ PATOFYZIOLOGIE RIBOZOMOPATIÍ

Předpokládá se, že hlavní podíl na molekulární podstatě ribozomopatií mají především dva vzájemně se nevylučující a silně provázané mechanizmy: aktivace tumorového supresoru p53 v reakci na ribozomální stres a pozměnění translace v důsledku změny počtu a/nebo funkce ribozomů. Výzkum posledních několika let navíc poukazuje i na významný podíl oxidačního stresu v patofyziologii těchto onemocnění.

Ribozomální stres a aktivace p53

Přestože je jadérko primárně známé svou rolí v biogenezi ribozomů, v současnosti se ukazuje, že se jedná o organelu s mnoha dalšími funkcemi. Ukazuje se, že jadérko funguje jako senzor široké škály různých buněčných stresorů (UV záření, chemoterapeutika, hypoxie, oxidační stres, teplotní šok aj.) a zprostředkovává aktivaci stresových signálních drah [29]. Mezi tyto stresory patří právě i aberantní exprese genů ovlivňujících ribozomální biogenezi. Hlavní odpovědí na ribozomální stres je aktivace p53 signalizace, přičemž nejlépe zdokumentovaný mechanizmus, aktivující tuto dráhu, zahrnuje vazbu RPs na Mdm2 protein. Mdm2 ubikvitinyluje tumorový supresor p53 a tím jej směřuje k proteazomální degradaci. Díky tomu se v buňce za fyziologických podmínek udržují jen nízké hladiny p53 [30]. V případě narušení biogeneze ribozomů dochází v jadérku k vytvoření specifických podmínek, které vedou k akumulaci volných RPs a ty po uvolnění z jadérka interagují v nukleoplazmě s Mdm2, čímž inhibují jeho schopnost degradovat p53 [31,32] (obr. 2).

Aktivace p53 a jeho následná signalizace představuje pravděpodobně centrální uzel v rozvoji hypoproliferativních klinických příznaků vrozených ribozomopatií. V důsledku jeho nadměrné aktivace totiž dochází k narušení průběhu buněčného cyklu, senescenci a apoptóze. Charakteristické proliferační defekty specifických tkání, např. buněk neurální lišty u TCS či erytroidních progenitorů v případě DBA, jsou přisuzovány mimo jiné i zvýšené náchylnosti těchto buněčných typů k aktivaci p53. Nicméně genetická i farmakologická deplece aktivity p53 vedla k úpravě jen některých symptomů ribozomopatií. Tato skutečnost v součinnosti s dalšími komplexními molekulárními patologiemi naznačuje nutný vliv i dalších mechanizmů jak na aktivaci p53, tak i na rozvoj samotného onemocnění [33].

Pozměněná translace a změny proteomu

Kromě důkazů o centrální úloze p53 v pa- tofyziologii ribozomopatií existuje rovněž řada důkazů i o vlivu pozměněné translace. Mutace v genech interferujících s ribozomální biogenezí vedou nejen ke globálnímu snížení úrovně syntézy proteinů, ale i k výrazným specifickým změnám translace. Změny proteomu v důsledku narušené translace by mohly být klíčem k alespoň částečnému pochopení tkáňové specifity ribozomopatií. Dvě poměrně recentní práce ukazují, že v důsledku snížené koncentrace ribozomů dochází u pacientů s DBA k snížení translace erytroidního transkripčního faktoru GATA1 [7,34]. Nízká hladina GATA1 vede k defektu erytropoézy, který se projevuje zpožděním diferenciace a zvýšenou apoptózou erytroidních buněk, což jsou hlavní znaky DBA. Kromě regulace exprese erytroidně specifických genů bylo v in vitro studii prokázáno, že GATA1 interaguje s p53 a inhibuje aktivaci p53 signální dráhy. To naznačuje, že snížená exprese GATA1 u DBA by mohla být dalším z mechanizmů spoluzodpovědných za nadměrnou aktivaci p53 [35]. Kromě narušené translace se na snížení množství GATA1 u DBA podílí i pokles hladiny chaperonu HSP70, který stabilizuje a chrání GATA1 před rozštěpením. V důsledku zvýšené proteazomální degradace dochází ve spojení s mutacemi v některých RP genech (např. RPL5, RPL11, RPS24) k výraznému poklesu HSP70 [36]. Význam role redukované hladiny GATA1 na charakteristický fenotyp DBA pak podtrhuje i zjištění, že mutace GATA1 mohou samy o sobě vést k rozvoji fenotypu podobného DBA. Mimo GATA1 jsou translačními defekty u DBA zasaženy i další specifické geny, které rovněž sehrávají klíčovou roli v proliferaci a diferenciaci erytroblastů [37].

Oxidační stres

V posledních letech narůstá počet studií, které naznačují významný vliv oxidačního stresu v patogenezi jednotlivých ribozomopatií [38–41]. Oxidační stres vzniká v důsledku akumulace reaktivních forem kyslíku (ROS), které jsou při zvýšených hladinách pro buňku toxické a vedou k inhibici proliferace a apoptóze. Mechanizmus toxicity zahrnuje oxidační poškození nukleových kyselin, proteinů a lipidů a také vede prostřednictvím narušení mitochondriálních funkcí k výrazným změnám v energetickém metabolizmu buňky. Zvýšené intracelulární hladiny ROS se navíc mohou prostřednictvím oxidativního poškození DNA významně spolupodílet i na aktivaci p53 [39].

Mechanizmy, kterými defektní biogeneze ribozomů způsobuje narušení redoxní homeostázy, nejsou dosud detailně pochopeny. Jednou z možností by mohly být právě všeobecné i selektivní defekty v translaci mRNA. Kupříkladu bylo zjištěno, že v DBA erytroidních prekurzorech dochází k narušení translace globinových řetězců a tím i rovnováhy mezi syntézou hemu a globinů. Přebytečný volný hem se pak podílí na nadměrné produkci ROS [42]. Na indukci ROS v hematopoetických progenitorech by se mohlo podílet i prozánětlivé mikroprostředí, které je výsledkem abnormální sekrece prozánětlivých faktorů buňkami tvořícími hematopoetickou niku [39,43].

Onkogenní mechanizmus somatických ribozomopatií

Onkogenní mechanizmy somatických ribozomopatií nejsou prozatím dostatečně vysvětleny. Předpokládá se, že by v důsledku pozměněné translace mohlo docházet k posunu v translačním profilu směrem k nadměrné syntéze proonkogenních proteinů a potlačení syntézy tumorových supresorů. V poměrně nedávno publikované práci bylo zjištěno, že rekurentní mutace R98S v genu RPL10, která se vyskytuje u 8 % pediatrických T-buněčných akutních lymfoblastických leukemií, vedla v leukemických buňkách k nadměrné translaci antiapoptotického faktoru BCL2 [44]. Jiná práce zase ukázala, že buňky s touto mutací vykazovaly zvýšenou expresi několika proteinů JAK/STAT signální dráhy, která řídí buněčnou proliferaci a přežití [45].

Dále se uvažuje, že potenciálním zdrojem onkogeneze by mohlo být i narušení neribozomálních funkcí mutovaných RPs, které zahrnují např. regulaci některých onkogenů a tumorových supresorů. V kontextu ribozomopatií je nejlépe charakterizovanou mimoribozomální funkcí RPs schopnost některých z těchto proteinů v reakci na ribozomální stres aktivovat p53 signalizaci. Ztrátové mutace v klíčových genech této signalizace, RPL5 či RPL11, mohou vést k narušení aktivace p53, a tím i větší náchylnosti k maligní transformaci [46]. Některé RPs navíc působí jako supresory významného onkogenu c-myc [47,48]. Ztráta těchto RPs by tak mohla vést k nádorové transformaci prostřednictvím zvýšené exprese c-myc. Vliv mutací v RP genech na rozvoj rakoviny může být zprostředkován také nepřímo. Výsledné ribozomální defekty totiž mohou vést ke komplexním metabolickým a redoxním změnám a v důsledku zvýšeného oxidačního poškození DNA pak může docházet k akumulaci sekundárních mutací urychlujících proces nádorové transformace [40].

Predispozice k nádorovým onemocněním u ribozomopatií

Přestože jsou časné projevy vrozených ribozomopatií charakteristicky spojené s různými defekty v buněčném růstu a dělení, pro většinu z nich byla popsána predispozice k rozvoji nádorových onemocnění. Paradox přechodu od hypoproliferace k hyperproliferativnímu onkogenímu fenotypu v pozdější fázi života pacientů byl poprvé popsán v roce 1967 doktorem W. Dameshkem a je znám jako tzv. „Dameshkova hádanka“ [49].

Tuto paradoxní proměnu fenotypu se pokusili vysvětlit Kampen et al. [2], kteří předpokládají, že přestože defekt v ribozomální biogenezi může od samého počátku prostřednictvím dysregulace onkogenů a nádorových supresorů podporovat progresi k nádorovému onemocnění, jiné buněčné změny tento efekt utlumí a vedou k potlačení proliferace. Významnou úlohu v přechodu od hypoproliferace k hyperproliferaci pak autoři připisují především působení oxidačního stresu. Ten svou toxicitou zpomaluje buněčnou proliferaci, ale zároveň svými mutagenními účinky může urychlovat vznik nových mutací. Některé z těchto mutací pak mohou pomoci buňkám překonat/obejít tlak mechanizmů vedoucích k hypoproliferaci a následná akumulace dalších genetických změn může dále urychlovat proces nádorové transformace [2,40]. Příkladem takové genetické změny mohou být mutace inaktivující p53. Nedávná studie ukázala, že právě somatické mutace TP53 se u pacientů s SDS podílejí na rozvoji MDS [50].

NOVÉ MOŽNOSTI LÉČBY VROZENÝCH RIBOZOMOPATIÍ

Současný standard léčby ribozomopatií se zaměřuje především na symptomatickou terapii. Farmakologická léčba kortikoidy a podávání transfuzních přípravků jsou spojené s příslušnými nežádoucími účinky. V případě steroidů jde o růstovou retardaci, vznik žaludečních vředů, náchylnost k infekcím a rozvoj osteoporózy, hypertenze a sekundárního diabetu. U pravidelného podávání transfuzí je nezbytná adekvátní chelatační léčba, k prevenci přetížení organizmu železem, které může vést k endokrinním dysfunkcím a závažné orgánové toxicitě [51]. Doposud jedinou kurativní léčbou hematologických projevů ribozomopatií je transplantace HSC, která však s sebou nese řadu závažných rizik a komplikací, vč. významné morbidity a mortality.

Vývoj nových léčiv

Kortikosteroidy navzdory mnoha pokusům o nalezení nových léčebných alternativ nadále zůstávají hlavním pilířem farmakologické léčby DBA [52].

Nejnadějnějším novým přístupem k léčbě DBA by mohla být terapeutická suplementace aminokyselinou L-leucinem. Tato aminokyselina je známá svou schopností stimulovat proteosyntézu [53]. V roce 2007 Pospíšilová et al. popsali první úspěšnou léčbu leucinem u pacientky závislé na podávání transfuzí [54]. Výsledky pilotní multiinstitucionální klinické studie fáze I/II (NCT01362595) ukázaly, že léčba leucinem vedla u 16 % DBA pacientů závislých na transfuzích k erytroidní odpovědi a u 36 % a 44 % pacientů došlo po několika měsících také ke zvýšení tělesné hmotnosti a lineární rychlosti růstu. Léčba leucinem navíc není při správném monitorování jeho hladiny spojena s žádnými významnými nežádoucími účinky [55].

Dalším zajímavým cílem z hlediska terapeutické intervence je TGF-b signální dráha. Nadměrná aktivace této dráhy je spojená s potlačením krvetvorby a její dysregulace byla zjištěna např. u DBA i SDS [56,57]. Inhibitory TGF-b signalizace, jako jsou sotatercept, luspatercept či galunisertib, podporují produkci erytrocytů a vedou ke zvýšení hemoglobinu a hematokritu u zdravých dobrovolníků, ale např. i u pacientů s b-talasemií, u kterých dochází ke stimulaci pozdní fáze erytroidní diferenciace a korekci neefektivní erytropoézy [58]. Potenciální využitelnost těchto látek v léčbě hematologických symptomů ribozomopatií podporují jak dobré výsledky testování u zvířecích modelů [59], tak výsledky klinických studií, které ukázaly efekt těchto látek při překonávání myelosuprese, neefektivní erytropoézy a zmírnění anémie u pacientů s nízkorizikovým MDS, pro něž je aberantní TGF-b signalizace rovněž charakteristická [60]. V roce 2019, resp. 2020, byl luspatercept schválen FDA a EMA pro léčbu dospělých pacientů s b-talasemií, kteří jsou závislí na transfuzích, a anemických MDS pacientů s prstenčitými sideroblasty, u kterých selhala léčba preparáty stimulujícími erytropoézu a zůstali závislí na transfuzích. Zatím jediná klinická studie (NCT01464164), jež měla za cíl zhodnotit bezpečnost a účinnost sotaterceptu u dospělých pacientů s DBA závislých na transfuzích, byla předčasně ukončena v souvislosti s pandemií COVID-19.

Rozsáhlý screening bioaktivních chemikálií k identifikaci látek schopných zvrátit endoteliální a morfologické defekty u rybího modelu DBA odhalil potenciál inhibitorů kalmodulinu. Jedním z těchto účinných inhibitorů byl i trifluoperazin, léčivo schválené FDA k léčbě schizofrenie. Příznivé účinky trifluoperazinu byly potvrzeny i na savčích modelech DBA a bylo zjištěno, že mechanizmus účinku zahrnuje snížení aktivity p53 [61,62]. Podobně jako v případě sotaterceptu byla klinická studie užití trifluoperazinu u DBA (NCT03966053) předčasně ukončena v souvislosti s pandemií COVID-19. Přehled potenciálních léčiv nově testovaných u různých vrozených ribozomopatií [63] je uveden v tab. 2.

Genová terapie

Genovou terapii je možné volně definovat jako zavedení genetického materiálu do buněk pacienta za léčebným účelem. Typicky se do cílových buněk pomocí vektoru dodává funkční verze požadovaného genu, aby se překonal jejich vnitřní genetický defekt. Vzhledem k tomu, že charakteristickým a výrazným klinickým rysem řady ribozomopatií je právě selhání kostní dřeně, jeví se tato skupina onemocnění jako dobrý cíl pro využití ex vivo genetické úpravy HSC. Oproti klasické alogenní transplantaci by odpadly komplikace spojené s hledáním vhodného dárce a následným předtransplantačním přípravným režimem. Na druhou stranu genová terapie vyžaduje u pacientů znalost mutovaného genu. To zcela znemožňuje léčbu poměrně velkého množství pacientů, u nichž je genetická příčina onemocnění neobjasněna. Účinnost a proveditelnost genové terapie u DBA byla hodnocena v několika studiích a její terapeutický potenciál byl rovněž ověřen in vivo na DBA myším modelu [64–68].

Nástup technologií pro cílenou úpravu genomu, zastoupený především nejnovějším nástrojem CRISPR/Cas9, odstartoval revoluci v oblasti genové terapie, jelikož umožňuje dosažení terapeutického účinku přímou korekcí kauzálních mutací. Oproti klasickému způsobu genové terapie se tak vyhýbá riziku inzerční mutageneze, a navíc si opravený gen zachovává pozici v rámci genomu, což přispívá k zajištění přirozené regulace jeho exprese. Několik výzkumných skupin již úspěšně aplikovalo technologii CRISPR/Cas9 ke korekci mutací, jež jsou příčinou jiných hematologických chorob. Např. Škvarová et al. [69] dokázali opravit a obnovit funkci mutovaného genu FANCD1 (BRCA2) v primárních fibroblastech získaných od pacientů s Fanconiho anémií (FA).

ZÁVĚR

Intenzivní výzkum posledních let odhalil komplexnost molekulární podstaty ribozomopatií a umožnil ozřejmit její dílčí aspekty. Definování mechanizmů, které se podílejí na patogenezi ribozomopatií, ústí i do vývoje a testování nových léčiv a je známkou významného vědeckého pokroku v boji proti této heterogenní skupině onemocnění.

SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK

AML – akutní myeloidní leukemie

ADA2 – adenosindeamináza 2

CHH – syndrom hypoplastických chrupavek a vlasů

DBA – Diamondova-Blackfanova anémie

DC – Dyskeratosis congenita

EMA – Evropská léková agentura

EPO – erytropoetin

FA – Fanconiho anémie

FDA – americký Úřad pro kontrolu potravin a léčiv

G-CSF – faktor stimulující kolonie granulocytů

GH – růstový hormon

HSC – hematopoetická kmenová buňka

HSP70 – heat shock protein 70

Mdm2 – mouse double minute 2

MDS – myelodysplastické neoplázie

mRNA – mesengerová RNA

pre-rRNA – pre-ribozomální RNA

ROS – reaktivní formy kyslíku

RP/RPs – ribozomální protein (y)

rRNA – ribozomální RNA

SBDS – Shwachman-Bodian-Diamond syndrome

SDS – Shwachmanův-Diamondův syndrom

TCS – Treacherův-Collinsův syndrom

TGF-β – transformující růstový faktor b

tRNA – transferová RNA

PODÍL AUTORŮ NA PŘÍPRAVĚ RUKOPISU

OJ – příprava rukopisu a obrázkové dokumentace

SK – podíl na přípravě rukopisu

KHK, DP a MH – korekce a revize rukopisu

 

PODĚKOVÁNÍ

Práce vznikla za podpory Ministerstva školství mládeže a sportu České republiky (8F20005) a Interního grantu Univerzity Palackého (IGA_LF_2023_002). Děkujeme Michalovi Lacekovi za cenné připomínky při přípravě rukopisu.

 

ČESTNÉ PROHLÁŠENÍ AUTORŮ

Autoři práce potvrzují, že v souvislosti s tématem, vznikem a publikováním tohoto článku nejsou ve střetu zájmu a vznik ani publikovaní článku nebylo podpořeno žádnou farmaceutickou firmou.

 

Doručeno do redakce dne: 6. 12. 2022.

Přijato po recenzi dne: 1. 2. 2023.

doc. Mgr. Monika Horváthová, Ph.D.

Ústav biologie

Lékařská fakulta Univerzity Palackého v Olomouci

Hněvotínská 3

775 15 Olomouc

e-mail: monika.horvathova@upol.cz

Transfuze Hematol Dnes 2023; 29(2): 106– 116