Výskyt sub-linie M1 UK mezi invazivními kmeny Streptococcus pyogenes typ emm1 izolovanými od prosince 2022 do května 2023 v České republice

ÚVOD

Streptococcus pyogenes (streptokok skupiny A, Group A Strep, GAS) je agens způsobující především akutní tonzilitidy, akutní otitidy, hnisavé infekce faryngu a infekční onemocnění kůže s klinickým obrazem ve formě impetiga či erysipelu, vyvolává však i systémová infekční onemocnění. Klinické manifestace invazivních onemocnění způsobených S. pyogenes zahrnují typicky nekrotizující fasciitidu, bakteriemii, sepsi a sepsi se streptokokovým syndromem toxického šoku. V roce 2023 se vyskytovaly v souvislosti se S. pyogenes invazivní onemocnění, jako jsou pneumonie a meningitida, která pro toto agens nejsou typická. V předchozích letech se invazivní onemocnění objevovala zvláště u polymorbidních pacientů, injekčních uživatelů drog a osob bez domova. Vážnost infekčního onemocnění vyvolaného S. pyogenes je ovlivněna kombinací řady faktorů, např. celkovým zdravotním stavem a stavem imunity hostitele, předchozím vznikem poranění, genetickými faktory, mírou expozice S. pyogenes a specifickou virulencí kmene. Uvádí se, že smrtnost v případě invazivních GAS onemocnění je navzdory okamžité léčbě antibiotiky v rozmezí 10–30 % [1]. Pokud se v populaci objevily nové nebo vzácně se vyskytující kmeny S. pyogenes, vždy to vedlo ke zvýšení výskytu GAS onemocnění. Významné změny v genomu, které ovlivňují strukturu a expresi virulentních faktorů, jsou spojovány s globální expanzí invazivních S. pyogenes (iGAS) [2]. Genom S. pyogenes obsahuje řadu genů virulentních faktorů a vykazuje vysokou genetickou diverzitu. M protein, kódovaný genem emm, je hlavní faktor virulence spojovaný s rezistencí bakterie k fagocytóze. Typizace S. pyogenes je založeno na sekvenční variabilitě N-koncové části genu emm. Nejčastěji zastoupené emm typy iGAS jsou emm1, emm28, emm89, emm3 a emm12 [3]. Kmeny GAS produkují exotoxiny a specifické superantigeny (SAg), které vyvolávají systémovou zánětlivou odezvu. Superantigeny se váží na molekuly MHC II (major histocompatibility complex class II) na povrchu antigen prezentujících buněk a současně na variabilní oblast β řetězce receptoru T lymfocytů. Tato interakce vede k aktivaci velkého množství T lymfocytů produkujících prozánětlivé cytokiny a k potlačení produkce imunoglobulinů [4]. V současné době je známo 13 SAg. Geny kódující SAg jsou převážně neseny na profázích nebo na jiných mobilních elementech, což umožňuje horizontální přenos genů mezi bakteriálními rody a druhy. Výjimkou jsou geny speG, speJ a smeZ, které jsou součástí chromozomu bakterie. Zvláštní úlohu má mezi SAg SpeB, multifunkční cysteinová proteáza. Ukazuje se, že SpeB může regulovat funkci ostatních SAg jejich proteolýzou. Proteáza SpeB je také faktor virulence, deaktivuje C3b část komplementu a štěpí imunoglobuliny [5].

Historie výskytu S. pyogenes M1UK

Od roku 2014 přibližně do roku 2016 byl v Anglii pozorován zvýšený výskyt spály a invazivních onemocnění vyvolaných S. pyogenes. Původcem tohoto zvýšeného výskytu byla identifikována invazivní sublinie S. pyogenes typu emm1 označená M1UK [6]. Tato sublinie byla charakterizována výskytem 27 jednonukleotidových polymorfismů (SNP) v genomu bakterie a zároveň odlišnou expresí sedmi genů ve srovnání s iGAS typu emm1 z předchozích let. U sublinie M1UK byla prokázána zvýšená produkce streptokokového pyrogenního exotoxinu A (SpeA) [7], která je zodpovědná za vyšší toxigenitu kmene. V průběhu let došlo ke globálnímu rozšíření této sublinie S. pyogenes M1UK [8, 9, 10].

Epidemiologie iGAS v České republice

Invazivní onemocnění vyvolaná S. pyogenes v České republice podléhají povinnému hlášení do Informačního systému infekčních nemocí (ISIN), ale není zaveden národní program surveillance. Do Národní referenční laboratoře pro streptokokové nákazy (NRL/STR) jsou z terénních laboratoří zasílány izoláty S. pyogenes z invazivních i neinvazivních onemocnění na bázi dobrovolnosti. V NRL/STR je u doručených izolátů S. pyogenes prováděna kontrola správné identifikace a typizace genu emm. V letech 2018–2022 bylo do NRL/STR doručeno celkem 389 izolátů S. pyogenes z invazivních i neinvazivních onemocnění, z toho 307 izolátů bylo z invazivních onemocnění. Nejméně izolátů bylo doručeno v roce 2021, a to 45 izolátů, což může souviset s v té době platnými protiepidemickými opatřeními proti šíření covid-19. Nejvíce izolátů bylo vyšetřeno v roce 2022, celkem 105 izolátů, z toho velká část byla doručena v poslední čtvrtině roku 2022. V letech 2018–2022 bylo do NRL/STR doručeno 38 izolátů S. pyogenes, které byly dány do souvislosti s úmrtím pacienta. Nejvíce úmrtí souvisejících s onemocněním S. pyogenes bylo zaznamenáno v roce 2022 – celkem 20 úmrtí, z toho 4 úmrtí byla nahlášena v listopadu 2022 a 8 úmrtí v prosinci 2022.

V prosinci 2022 došlo k výraznému nárůstu počtu zaslaných izolátů S. pyogenes do NRL/STR a k celorepublikovému zvýšení výskytu případů jak neinvazivních, tak invazivních onemocnění vyvolaných S. pyogenes a tento trend pokračuje i v roce 2023. Na zvýšení výskytu onemocnění způsobených S. pyogenes se pravděpodobně podílelo uvolnění protiepidemických opatření, sezonní cirkulace respiračních virů a v následujícím roce 2023 pravděpodobně též situace snížené dostupnosti penicilinu. NRL/STR oslovila v lednu 2023 mikrobiologické laboratoře v terénu, aby v zájmu zlepšení monitorování situace výskytu iGAS zasílaly do NRL/STR izoláty S. pyogenes z invazivních onemocnění.

V období od ledna do července 2023 bylo do NRL/ STR doručeno 384 izolátů GAS, z toho 287 izolátů bylo z invazivního onemocnění. Nejvíce izolátů bylo doručeno v dubnu 2023, a to 76 vzorků, z toho 60 bylo z invazivních onemocnění. V NRL/STR bylo v období ledna až července 2023 zaznamenáno celkem 44 úmrtí v souvislosti s onemocněním S. pyogenes, nejvíce úmrtí bylo dokumentováno v květnu 2023 – celkem 12 úmrtí. Monitorováním vyskytujících se emm typů bylo zjištěno, že převažujícím emm typem je emm1 – od ledna 2023 do července 2023 bylo 46 % všech iGAS typu emm1. V předchozích letech 2015–2022 bylo průměrně zaznamenáno 18 % izolátů iGAS emm1 (nejméně v roce 2021 – 2 %, nejvíce v roce 2016 – 29 %). Dále se zvýšil výskyt typů emm12, emm49 [11].

MATERIÁL A METODY

Kmeny

Do studie byly vybrány kmeny S. pyogenes typu emm1 získané v letech 2018, 2019 a od konce roku 2022 do května roku 2023. Z let 2018 a 2019 bylo vybráno 5 izolátů iGAS. Z období prosinec 2022 až květen 2023 bylo zvoleno 36 kmenů izolovaných od pacientů s anamnézou invazivního onemocnění vyvolaného S. pyogenes, případně z náhlých úmrtí. Invazivita onemocnění byla hodnocena na základě udané diagnózy a především na základě materiálu, ze kterého byl S. pyogenes získán. Ze studovaného souboru 41 izolátů byl ve 36 případech S. pyogenes izolován z hemokultury, v 1 případě z mozkomíšního moku a ve 3 případech z pitevního materiálu. V jednom případě se jedná o izolát z neinvazivního materiálu od pacienta, jehož příbuzný prodělal invazivní onemocnění vyvolané S. pyogenes. Věkový průměr pacientů ve studovaném souboru, od nichž byl S. pyogenes získán, je 31 let, nejmladšímu pacientovi byly 2 roky, nejstaršímu pacientovi bylo 73 let. Ve 23 případech se jednalo o pacientky ženského pohlaví, 18 případů bylo získáno od pacientů mužského pohlaví. Všechny případy jsou z České republiky až na jeden případ, kdy byl kmen S. pyogenes izolován na Slovensku. Autorům studie je známo, že minimálně 17 případů skončilo úmrtím.

Identifikace a typizace genu emm

Kmeny iGAS zahrnuté do studie, stejně jako všechny ostatní kmeny S. pyogenes doručené do NRL/STR, byly podrobeny rutinní kontrole správné identifikace. Kmeny byly kultivovány přes noc na krevním agaru (CO agar, Oxoid) v atmosféře s 5% CO₂, následně byla hodnocena beta hemolýza. Dále bylo provedeno testování streptokokového skupinového antigenu A latexovou aglutinací pomocí Streptococcal Grouping Kit (Oxoid) a testována reakce v PYR testu (PYR Disc w/ Reagent, Remel), kdy byla zjišťována produkce enzymu pyrrolidonyl arylamidázy. Následovala typizace genu emm podle protokolu z CDC (https://www.cdc.gov/stre- plab/groupa-strep/emm-typing-protocol.html). Dlouhodobě jsou kmeny skladovány v kryozkumavkách (ITEST KRYOBANKA B, ITEST plus s.r.o.) při -70 °C ve sbírce NRL/STR.

Izolace genomové DNA a celogenomová sekvenace

Izoláty iGAS typu emm1 z let 2018 a 2019 byly sekvenovány s využitím sekvenátoru MiSeq (Illumina) na pracovišti EMBL (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Německo). Izoláty iGAS z roku 2022 a 2023 byly sekvenovány v SZÚ přístrojem MiSeq (Illumina). Genomová DNA vybraných vzorků S. pyogenes byla izolována QIAamp® DNA Mini Kit (QIAGEN) s upraveným protokolem pro gram-pozitivní bakterie. Ke fragmentaci DNA byl použit přístroj Covaris M220 Focused-ultrasonicator. Příprava DNA knihovny byla provedena použitím xGen DNA Library Prep MC Kit (IDT).

Zpracování dat z celogenomové sekvenace

Kvalita získaných sekvenačních dat byla hodnocena programem FastQC. K sestavení genomů z primárních sekvenačních dat byl použit de novo assembler Unicycler verze v0.4.8 [12], který je nástrojem volně online dostupného Bacterial and Viral Bioinformatic Center (BV-BRC) https://www.bv-brc.org [13]. Unicycler byl v tomto případě schopen skládat krátké ready, přičemž funguje jako SPAdes-optimalizátor
(https://www.bv-brc.org/docs/quick_references/services/comprehensive_genome_analysis_service.html). Hloubka pokrytí pro každý izolát byla >50x. Ke zjištění sekvenčního typu ST a přítomnosti genů superantigenů speA, speC, speG, speH, speI, speJ, speK, speL, speM, smeZ a ssa z celogenomových dat byl použit nástroj Comprehensive Genome Analysis, který je součástí BV-BRC. Typy kmenů emm1 invazivních GAS získané použitím databáze PubMLST podporované platformou Bacterial Isolate Genome Sequence Database (BiGSdb) [14] byly také ověřeny nástrojem Comprehensive Genome Analysis. Jednonukleotidové polymorfismy byly stanoveny proti cílovému genomu referenčního kmene invazivního S. pyogenes MGAS5005 typ emm1 izolovaného z mozkomíšního moku v Kanadě v roce 1996 [15] použitím nástroje Variation Analysis, který je součástí BV-BRC a využívá aligner BWA-mem [16] a SNP Caller FreeBayes [17].

Fylogenetická analýza

Phylogenetic Tree Service v BV-BRC byl použit ke konstrukci fylogenetických stromů ze studovaných genomů. Nástroj Codon Tree umožnil náhodně vybrat 1000 single-copy BV-BRC globálních proteinových rodin PGFam [18] a použitím programu RAxML verze 8 [19] byly analyzovány zarovnané proteiny a kódující DNA ze single-copy genů s parametry Max Allowed Deletion 0 a Max Allowed Duplication 0. Do fylogenetické analýzy byly zahrnuty anotované genomy sekvenovaných iGAS kmenů typ emm1 izolovaných v České republice v letech 2018–2023, 4 kmeny iGAS typ emm1 izolované v Anglii v roce 2014 charakterizované jako sublinie M1UK [6] a referenční kmen S. pyogenes MGAS5005. WGS data uvedených iGAS kmenů izolovaných v Anglii byla získána v databázi European Nucleotide Archive (ENA) https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB17673.

VÝSLEDKY

Fylogenetická analýza

Fylogenetická analýza anotovaných genomů izolátů iGAS typu emm1 ukázala vývoj emm1 typů v období let 2018 a 2019 a od prosince 2022 do května 2023. Stejně jako v mnoha jiných zemích tak i v České republice došlo mezi izoláty iGAS k rozšíření sublinie M1UK. V letech 2018 a 2019 bylo do NRL pro streptokokové nákazy doručeno pouze 21 izolátů iGAS typu emm1 (tab. 1). Z období 2018 až 2019 bylo sekvenováno 5 kmenů iGAS typu emm1, z toho 4 kmeny neodpovídají sublinii M1UK. Tyto kmeny spolu se třemi kmeny z období 2022 až 2023 tvoří oddělený klon od sublinie M1UK (obr. 1).

Detekce vybraných jednonukleotidových polymorfismů v core genomu

Data celogenomové sekvenace byla získána pro 41 iGAS izolátů typu emm1 získaných v letech 2018, 2019 a od prosince 2022 až do května 2023 (tab. 2). Sublinie M1UK, která je spojována se zvýšeným výskytem spály a invazivních onemocnění v Anglii v letech 2014–2016, je charakterizována 27 SNP v regulačních a metabolických genech (tzv. core genome). Tři non-synonymní mutace byly identifikovány v genu rofA [6], který kóduje transkripční regulátor RofA. RofA je považován u některých genotypů za represor produkce streptokokového pyrogenního exotoxinu SpeA. Ze 41 sekvenovaných iGAS izolátů typu emm1 32 vykazovalo v genomu uvedených 27 SNP definovaných pro M1UK se třemi mutacemi v genu rofA. U dvou dalších izolátů bylo nalezeno pouze 26 z těchto 27 SNP. Chybí non-synonymní SNP v locusu genu M5005_Spy1860. Sublinie M1UK s chybějící jednou mutací byla také publikována [20]. Sedm kmenů iGAS nevykazovalo žádnou z definovaných SNP, z toho čtyři kmeny byly izolovány v letech 2018 a 2019.

Detekce genů superantigenů

U každého sekvenovaného izolátu analýzou genomu (Comprehensive Genome Analysis) BV-BRC byla stanovena přítomnost genů superantigenů speA, speC, speG, speH, speI, speJ, speK, speL, speM, smeZ a ssa. U iGAS izolátů převažuje profil genů superantigenů charakteristický pro S. pyogenes typ emm1. To znamená přítomnost genů streptokokových pyrogenních exotoxinů speA, speG, speJ a streptokokového mitogenního exotoxinu smeZ [21]. U dvou ze 41 sekvenovaných izolátů iGAS chybí gen speA. U dvou kmenů, který nepatří k sublinii M1UK, byl identifikován gen streptokokového pyrogenního exotoxinu C (speC). Gen speC byl nalezen i u dvou izolátů odpovídajících přítomností 27 definovaných SNP sublinii M1UK.

Tabulka 1. Distribuce S. pyogenes typ emm1 mezi iGAS v letech 2015–2023
Table 1. Distribution of emm1 S. pyogenes among iGAS in 2015–2023

*vzorky doručené do NRL do 4. 8. 2023; invazivní vzorek – izolát z primárně sterilní lokalizace
*specimens referred to the NRL until 4 August 2023; invasive isolate – isolate from a primarily sterile site

Obr. 1. Fylogenetický vztah mezi vybranými kmeny iGAS typ emm1 z České republiky izolovanými v letech 2018 až 2023 a kmeny iGAS globálně rozšířené sublinie M1UK izolovanými v UK v roce 2014 Bakteriální fylogenetický strom byl generován Codon Tree pipeline. Využívá aminokyselinové a nukleotidové sekvence z definovaného počtu 1000 BV-BRC globálních proteinových rodin (PGFam), které byly vybrány náhodně. Zeleně jsou značeny kmeny iGAS obsahující SNP definované pro sublinii M1UK izolované v České republice v letech 2018 až 2023. Žlutě jsou značeny kmeny iGAS, které neobsahují žádný z uvedených SNP definovaných pro sublinii M1UK izolované v České republice v letech 2018–2023. Modře jsou značeny kmeny sublinie M1UK izolované v UK v roce 2014. Červeně je značen referenční kmen invazivní S. pyogenes MGAS5005 typ emm1 izolovaný v roce 1996 v Kanadě. Jednotka délky větve udává pravděpodobnost, že daná pozice nukleotidu v genomu bude substituovaná.
Figure 1. The phylogenetic relationship between selected emm1 iGAS strains from the Czech Republic isolated in 2018–2023 and iGAS strains of the globally distributed M1UK sublineage isolated in the UK in 2014 The bacterial phylogenetic tree was generated by the Codon Tree pipeline. It uses amino acid and nucleotide sequences from a defined number of 1000 BV-BRC global protein families (PGFam), which were randomly selected. Green indicates iGAS strains containing SNPs defined for the M1UK sublineage isolated in the Czech Republic between 2018 and 2023. Yellow indicates iGAS strains that do not contain any of the SNPs defined for the M1UK sublineage isolated in the Czech Republic between 2018 and 2023. Blue indicates iGAS strains of the M1UK sublineage isolated in the UK in 2014. Red indicates the reference strain S. pyogenes MGAS5005 isolated in 1996 in Canada. The branch length unit indicates the probability that a given nucleotide position in the genome will be substituted.

Tabulka 2. Distribuce SNP definovaných pro sublinii M1UK v sekvenovaných iGAS typu emm1 a zastoupení genů jednotlivých superantigenů
Table 2. Distribution of SNPs defined for the M1UK sublineage in sequenced emm1-type iGAS and representation of individual superantigen genes

DISKUSE

Epidemiologie výskytu iGAS v České republice odráží významný nárůst invazivních onemocnění od prosince roku 2022 a během první poloviny roku 2023. Toto období přichází po dvou letech restrikcí spojených s protiepidemickými opatřeními proti šíření covid-19 v letech 2020 a 2021. Při zavedených protiepidemických opatřeních docházelo jen v omezené míře k mezilidskému přenosu jak respiračních virů, tak i bakterií osidlujících dýchací cesty člověka. Imunita tedy nebyla dostatečně „trénovaná“ pravidelným kontaktem s různými viry a bakteriemi a vznikl tzv. „imunitní dluh“ [22]. Nyní při rozvolnění a zrušení protiepidemických opatření nastává tzv.„rebound“ efekt neboli efekt zpětného rázu, který může být tím silnější, čím déle trvala protiepidemická opatření a čím nižší je tzv. kolektivní imunita [22]. Závažná streptokoková onemocnění na rozdíl od období před pandemií, kdy byli postiženi hlavně polymorbidní pacienti, injekční uživatelé drog a lidé bez domova, se vyskytují nově u dětí a dosud zdravých dospělých středního věku. Věkový průměr pacientů, u kterých se NRL pro streptokokové nákazy podařilo získat izoláty z primárně sterilních míst v období prosinec 2022 až červenec 2023, byl 51,5 let, přičemž průměrný věk v letech 2018–2021 pacientů s iGAS byl 56,7 let. Stejný trend poklesu věkové hranice pacientů s invazivním infekčním onemocněním ve srovnání s předchozími roky byl zaznamenán např. v Dánsku [23]. Dochází také ke změně klinické manifestace. Zvýšil se počet izolátů S. pyogenes, které vyvolaly invazivní onemocnění ve formě sepse s rychlou progresí klinického stavu, s toxickým šokem a nekrotizující infekce měkkých tkání s protrahovanou odezvou na antibiotickou léčbu a s vyskytující se reinfekcí po vysazení antibiotik. Objevuje se také nárůst případů meningitidy a pneumonie způsobené S. pyogenes [24, 25]. Nezanedbatelným faktorem, který může ovlivnit nárůst invazivních onemocnění způsobených S. pyogenes, je sezonní vyšší výskyt respiračních virů [26, 27] a viru varicella zoster [25] v zimě 2023 a v České republice pak špatná dostupnost penicilinu [25, 28, 29]. V letech 2014–2016 byl v Anglii zaznamenán neočekávaný nárůst spály a invazivního infekčního onemocnění způsobeného S. pyogenes typu emm1. Invazivní izoláty byly podrobeny celogenomové sekvenaci a na základě nálezu 27 specifických mutací v regulačních a metabolických genech byla definována nová linie typu emm1 nazvaná následně linie M1T1 S. pyogenes neboli M1UK [6]. První izolát sublinie M1UK byl izolován v Londýně v roce 2010, přičemž v letech 2009 až 2012 byly v Anglii identifikovány izoláty charakterizované 13 nebo 23 z těchto jedinečných 27 mutací. U sublinie M1UK byly prokázány tři non-synonymní mutace v genu rofA, který kóduje transkripční regulátor RofA [30]. RofA potlačuje transkripci genů speA, pel-sagA a mga a v některých genotypech S. pyogenes se považuje za represor produkce SpeA [6, 31]. Tento ve zvýšené míře toxigenní kmen byl následně detekován v dalších zemích Evropy, v Kanadě a v USA [8, 9, 10]. V zmíněném roce 2016 byl v ČR zaznamenán zvýšený počet případů invazivních onemocnění vyvolaných S. pyogenes. V roce 2017 počty případů invazivních onemocnění klesaly. Data z celogenomové sekvenace izolátů z tohoto období nejsou k dispozici a další došetření nebylo provedeno. Analýzou mutací u čtyř z pěti sekvenovaných invazivních izolátů izolovaných v letech 2018 a 2019 se nepodařilo prokázat přítomnost definových SNP charakteristických pro kmeny iGAS patřících k sublinii M1UK, tedy ani mutací v genu rofA. V České republice během vzestupu invazivních onemocnění od prosince 2022 a v první polovině roku 2023 dominují iGAS typ emm1 a převaha emm1 izolátů patří k sublinii M1UK. U iGAS izolátů převažuje profil genů superantigenů charakteristický pro S. pyogenes typ emm1. To znamená přítomnost genů streptokokových pyrogenních exotoxinů speA, speG, speJ a streptokokového mitogenního exotoxinu smeZ.

U dvou kmenů, které nepatří k sublinii M1UK, se identifikoval gen streptokokového pyrogenního exotoxinu C (speC). Tyto kmeny nenesly žádný z 27 SNP definovaných pro sublinii M1UK. U těchto dvou izolátů iGAS bylo provedeno srovnání nalezených mutací s 15 SNP charakteristickými pro invazivní kmeny S. pyogenes typ emm1 sublinie M1DK identifikovaných v Dánsku v období 2022–2023 [32]. U žádného z těchto kmenů nebyla potvrzena shoda ani jedné definované mutace a příslušnost k sublinii M1DK nebyla potvrzena ani fylogenetickou analýzou (data nejsou uvedena). Gen speC, stejně jako gen speA, je nesen na fágovi a vyskytuje se v profilu superantigenů charakteristickém pro S. pyogenes typu emm28 a emm12, které tvoří další četně zastoupené emm typy iGAS izolované v České republice od prosince 2022 do konce července 2023. Ve studii izolátů iGAS 46 různých emm typů v Německu v letech 2009–2014 bylo uvedeno, že u 42,0 % vzorků byl identifikován gen speC [3].