Využití PCR-HRMA při přímé detekci a identifikaci původců dermatofytóz z klinických vzorků

Souhrn

Cílem studie bylo otestovat použitelnost metody PCR v kombinaci s High Resolution Melting Analysis (HRMA) pro detekci a identifikaci dermatofytů přímo z klinických vzorků kůže a jejích adnex. Metodika by měla vést ke zrychlení a zvýšení výtěžnosti diagnostiky dermatomykóz a ke zkvalitnění péče o pacienta. Ve studii bylo analyzováno 128 klinických vzorků od pacientů s podezřením na dermatomykózu. Pro izolaci DNA dermatofytů z klinického materiálu byl použit izolační KIT ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep^TM. Pro detekci DNA oblastí kódujících ribozomální RNA byly využity dvě sady primerů zachycující široké spektrum dermatofytů. Pro druhovou identifikaci dermatofytů byla použita real-time PCR metoda v kombinaci s High Resolution Melting Analysis (PCR-HRMA).

Dermatofytóza byla potvrzena u 42 ze 128 zkoumaných vzorků (pozitivní přímá mikroskopie, kultivace, detekce PCR-HRMA, nebo kombinace metod). Výtěžnost PCR detekce byla 74 % pro obě sady primerů, metoda HRMA umožnila ve všech případech druhovou identifikaci detekovaných dermatofytů pomocí PCR. Naproti tomu kultivace byla pozitivní pouze u 52 % pacientů s dermatofytózou. Mikroskopie ze vzorku byla pozitivní v 90 % pozitivních dermatofytóz. Při současném použití mikroskopie, kultivace a PCR-HRMA bylo úspěšně identifikováno na úroveň druhu 90 % dermatofytů. Nejčastější druhy dermatofytů (Trichophyton rubrum, T. interdigitale, T. benhamiae) byly touto metodikou spolehlivě zachyceny. PCR detekce rDNA přímo z klinického materiálu s využitím HRMA zvýšila výtěžnost diagnostiky dermatofytóz zvláště tím, že přispěla k dosažení druhové identifikace u výrazně vyššího počtu případů v porovnání s konvenčními metodami. Kombinace konvenčních a molekulárně biologických vyšetření se zdá být vhodná pro rychlou a spolehlivou diagnostiku dermatofytóz bez nutnosti výrazného navýšení nákladů.

Klíčová slova:

Trichophyton benhamiae – dermatofyty – přímá identifikace – ribozomální DNA

ÚVOD

Infekce způsobené dermatofyty jsou jedny z nejčastějších kožních infekcí na světě a náklady spojené s jejich diagnostikou a léčbou každoročně přesahují 400 milionů dolarů [2]. Celosvětová prevalence dermatomykóz je 20–25 % [14]. Nejčastěji se vyskytujícím onemocněním způsobeným dermatofyty v rozvinutých zemích je tinea unguium, jejíž prevalence se v evropské populaci odhaduje na 12,4 % [19], zatímco ve vyšších věkových skupinách může dosahovat až 50 % [21]. Podle poslední epidemiologické studie založené na kultivačně pozitivních případech dermatofytóz, jsou nejběžnějšími klinickými jednotkami v České republice tinea unguium (55,5 %), dále tinea corporis (29,2 %), tinea pedis (14,6 %) a tinea capitis (0,7 %). Dominantní druhy dermatofytů ve spektru původců dermatomykóz u nás jsou Trichophyton rubrum (79,2 %), T. benhamiae (7,2 %), T. interdigitale (7,1 %) a Microsporum canis (3,6 %) [16].

Klasické metody pro detekci a identifikaci dermatofytů z klinických vzorků kůže zahrnují přímou mikroskopii klinického materiálu a identifikaci narostlých kultur mikro- a makromorfologicky. Časová náročnost kompletní diagnostiky dermatomykóz je minimálně 10–15 dní a často však až 3–4 týdny. Mikroskopické a kultivační metody mají nízkou senzitivitu, 50–70 % [4], proto je nutné odběr klinického vzorku mnohdy opakovat, aby bylo dosaženo zvýšení záchytu původce dermatomykózy, a tím se čas mezi odběrem vzorku a vlastní diagnózou prodlužuje. Diagnostiku dermatomykózy je možné urychlit a zvýšit její výtěžnost pomocí detekce DNA původce přímo z klinického materiálu metodou PCR [3, 5, 22]. Real-time PCR metoda kombinovaná s následnou analýzou křivek tání s vysokým rozlišením (High Resolution Melting Analysis; PCR-HRMA) se zdá být  slibnou alternativou pro současnou diagnostickou praxi [9], a to zejména z hlediska citlivosti metody, finanční efektivity, ale také díky možnosti přímo identifikovat základní druhy původců. Tato metoda se mimo jiné také používá k rychlé typizaci lékařsky významných virů a bakterií, pro identifikaci druhů rodu Candida, zástupců řádu Mucorales apod. [13, 17, 18].

V této studii jsme testovali použitelnost metodiky přímé detekce DNA dermatofytů pomocí PCR v klinických vzorcích v kombinaci s HRMA, umožňující identifikaci běžných patogenů na úroveň druhu. Cílem studie bylo ověření efektivity metody PCR-HRMA při identifikaci dermatofytů a zrychlení diagnostiky dermatofytóz pro rutinní praxi.

MATERIÁL A METODY

Klinický materiál

Do studie byly zahrnuty všechny klinické vzorky (kůže a adnexa) běžně zasílaného pro rutinní diagnostiku suspektních dermatomykóz do Laboratoře klinické mykologie Zdravotního ústavu se sídlem v Ostravě ze spádové oblasti Moravskoslezského kraje v období 20. 3. 2017 až 20. 7. 2017. Na uvedeném pracovišti byly klinické vzorky zpracovány a podrobeny rutinní detekci a identifikaci dermatofytů zahrnující přímou mikroskopii klinického materiálu a identifikaci narostlých kultur mikromorfologicky a makromorfologicky. Vyšetřovaný materiál zahrnoval nehtové šupiny a podnehtovou drť, kožní šupiny a vlasy.

Molekulárně biologické metody

Ve studii bylo analyzováno 128 vzorků od pacientů s podezřením na dermatomykózu. Pro izolaci rDNA mikromycetů z klinického materiálu byl použit izolační KIT ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep^TM (Zymo Research, Californie, USA). Izolace probíhala podle pokynů výrobce. Prvním krokem bylo rozrušení vzorků klinického materiálu pomocí zirkoniových kuliček. Následovala izolace DNA pomocí pufrů a izolačních kolonek. Takto získaná DNA byla použita pro real-time PCR.

K detekci rDNA byly využity dvě PCR metody využívající dvojice primerů zachycující široké spektrum dermatofytů. První metoda byla zacílena na amplifikaci ITS1-5,8S oblasti, kdežto druhá amplifikovala celou oblast ITS rDNA (ITS1-5,8S-ITS2). Sekvence použitých primerů a sond jsou uvedeny v tabulce 1. Obě analýzy byly provedeny na přístroji LightCycler 96 (Roche, Basel, Switzerland).

Amplifikace úseku ITS1-5,8S byla provedena při následujících podmínkách: PCR reakce byla provedena při finálním objemu 20 µl, směs obsahovala 5 µl DNA z klinického vzorku, 15 µl reakčního mixu, který obsahoval 10 µl TaqMan_® Fast Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA), 10 pmol každého z dvojice primerů, a 4 pmol TaqMan sondy; teplotní profil amplifikace zahrnoval aktivaci uracil-DNA-glykosylázy (50°C/2 min), úvodní denaturaci 95 °C/20 s a 40 amplifikačních cyklů sestávajících z denaturace 95 °C/3 s, annealingu včetně elongace a měření signálu při 60 °C/30 s. Hodnocení reakce bylo kvalitativní, pozitivní izoláty byly dále postoupeny druhové identifikaci metodou real-time PCR-HRMA.

Pro druhovou identifikaci nejvýznamnějších druhů byla použita real-time PCR-HRMA oblasti ITS1-5,8S-ITS2. Amplifikace úseku ITS1-5,8S-ITS2 byla provedena při následujících podmínkách: PCR reakce byla provedena při finálním objemu 20 µl, směs obsahovala 5 µl DNA z klinického vzorku, 15 µl reakčního mixu, který obsahoval 12,5 µl Type-it HRM PCR Master Mix 2× (Qiagen, Hilden, Germany) s fluorescenčním markerem EvaGreen, 17,5 pmol každého z dvojice primerů; teplotní profil amplifikace zahrnoval úvodní denaturaci 95 °C/5 min a 45 amplifikačních cyklů sestávajících z denaturace 95 °C/10 s, annealingu 55° C/30 s a elongace 72 °C/10 s. Následná HRMA analýza probíhala rychlostí 0,05 °C/s v rozsahu 65–95 °C a kontinuálním čtením fluorescence (20 čtení/s). Hodnocení reakce je umožněno porovnáním křivek tání se standardy pro druhy Trichophyton rubrum, T. benhamiae, T. interdigitale a T. tonsurans. Vzorky, které byly pozitivní, ale nevykazovaly pík shodný s použitými standardy, byly dále identifikovány pomocí sekvenační analýzy [5, 9].

VÝSLEDKY

Ve 42 případech (33 %) ze 128 odběrů vzorků klinicky suspektních na mykotickou etiologii byla diagnóza potvrzena buď konvenčními metodami (přímá mikroskopie, kultivace), metodou PCR-HRMA, nebo jejich kombinací. Data o prokázaných případech dermatofytóz jsou shrnuta v tabulkách 2 a 3. Ze všech 42 potvrzených dermatofytóz byla zastoupena tinea unguium ve 28 případech (67 %), tinea corporis v 8 (19 %), tinea pedis v 5 (12 %) a tinea faciei v 1 případě (2 %).

Pozitivní nález v přímé mikroskopii byl přítomen u 38 ze 42 (90 %) potvrzených případů dermatofytózy. Běžně používanou kombinací metod přímé mikroskopie a následné kultivace bylo identifikováno pouze 22 ze 42 (52 %) původců dermatofytózy. Žádné mikroskopicky negativní klinické vzorky nebyly kultivačně pozitivní (viz tab. 2 a 3). PCR detekce byla úspěšná ve 31 případech ze 42 (74 %) pro obě použité metody, metoda HRMA umožnila ve všech případech druhovou identifikaci PCR pozitivních nálezů. V našem souboru 128 pacien­tů zvýšilo současné použití mikroskopie, kultivace a PCR-HRMA úspěšnost diagnostiky dermatofytóz z 38 na celkový počet 42 případů. Druhové identifikace bylo dosaženo u 38 ze 42 případů (90 %), oproti 22 případům (52 %) za použití kultivace a následné fenotypové identifikace.

S využitím přímé detekce dermatofytů z  klinického materiálu metodou PCR-HRMA se zvýšila úspěšnost identifikace původců o 22 % oproti klasické identifikaci (kultivace, makro- a mikromorfologie). Výsledek je patrný z grafu 1. Nejčastější původci v našem souboru vzorků, T. rubrum, a T. benhamiae, byly touto metodikou spolehlivě zachyceny a identifikovány pomocí typických křivek tání vynesených v časovém diagramu – graf 2. Trichophyton interdigitale byl detekován pomocí PCR-HRMA v jednom ze dvou případů zastoupených v našem souboru (viz tab. 2); typická křivka tání dovede tento druh jednoznačně odlišit od obou jmenovaných druhů.

DISKUSE A ZÁVĚR

Ačkoliv identifikace dermatofytů pomocí makro- a  mi-kromorfologických znaků je považována za zlatý standard, nemusí být jednoduchá a spolehlivá [6, 8, 11, 15]. V diagnostice dermatomykóz proto někteří autoři dokonce od tohoto „zlatého standardu“ ustupují [20]. Správná identifikace druhů dermatofytů je důležitá pro zahájení včasné a cílené terapie dermatomykózy, a také pro detekci zdroje infekce [1, 16]. Vzhledem k existující možnosti terapie azolovými preparáty a značně variabilní citlivosti antropofilních, zoofilních a geofilních dermatofytů k těmto antimykotikům je včasná identifikace původců tohoto onemocnění žádoucí [12]. V nedávných studiích byly jako alternativní metody pro identifikaci dermatofytů použity různé soupravy založené na amplifikaci nukleových kyselin, jako je sekvenování DNA, PCR-RFLP, Nested-PCR, PCR-ELISA a mikročipy (microarray). Tyto metody mají několik výhod oproti klasické přímé mikroskopii a kultivaci klinického materiálu, včetně vyšší citlivosti, rychlosti, a objektivity [7, 10, 22]. Nicméně hlavní nevýhodou těchto metod jsou často jejich vysoké náklady. Vzhledem k tomu, že v praxi je potřeba analyzovat množství vzorků, jsou zapotřebí rychlé a ekonomicky nenáročné metody, mezi které patří i zde studovaná metoda PCR-HRMA. Podobně jako ve studii Spiliopoulou et al. [22], bylo i v této práci pomocí alternativní metody přímé detekce dermatofytů z klinického materiálu dosaženo zvýšení výtěžnosti v detekci a identifikaci dermatomykóz o 22 %, a při současném použití klasických metod a PCR-HRMA bylo úspěšně identifikováno 90 % původců dermatomykózy.

Metoda PCR-HRMA se zdá být dobře využitelná pro přímou detekci a identifikaci dermatofytů z klinického materiálu v rutinní praxi. Kombinace klasických a molekulárně biologických vyšetření se jeví jako vhodná metodika pro rychlou a spolehlivou diagnostiku dermatomykóz. Ve čtyřech případech nedošlo k úspěšné kultivaci dermatofytů, ani detekci metodou HRMA, přestože přímá mikroskopie klinického materiálu byla pozitivní. V sedmi případech se detekce a identifikace patogena metodou PCR-HRMA nezdařila, přestože přímá mikroskopie i kultivace byla pozitivní. Tato situace mohla vzniknout následkem nedostatečné homogenity vzorku. Poloviční efektivita je patrná i v případě identifikace T. interdigitale (viz tab. 2), přestože typická křivka tání dovede tento druh jednoznačně odlišit od jiných druhů (viz graf 2). Tento problém proto rovněž přikládáme nedostatečné homogenitě klinického vzorku použitého pro kultivaci a PCR detekci. Řešením by mělo být vypracování metodiky pro lepší homogenizaci vzorku před samotnou izolací DNA, která by měla zásadně zvýšit výtěžnost této metody. Je proto nutno dále rozvíjet metodiku přípravy vzorků z tohoto náročného klinického materiálu, jakým je kůže a deriváty, zejména nehty. Nezbytné je zdůraznit, že diverzita dermatofytických hub není vzhledem k menšímu počtu použitých klinických vzorků v krátkém sledovaném období příliš rozmanitá, nicméně kopíruje epidemiologickou situaci v České republice [16]. Vzhledem k tomu, že prospektivní studie dále pokračuje, bude zdokonalení tohoto postupu a rozšíření souboru sledovaných vzorků publikováno v budoucnu.

Poděkování

Studie byla podpořena projekty Ministerstva zdravotnictví České republiky (AZV 17-31269A) a Interní grantovou agenturou Univerzity Palackého v Olomouci (IGA_LF_2017_031).

Do redakce došlo dne 13. 4. 2018

Adresa pro korespondenci:

Mgr. Radim Dobiáš

Oddělení bakteriologie a mykologie

Centrum klinických laboratoří

Zdravotní ústav se sídlem v Ostravě

Partyzánské náměstí 7

702 00 Ostrava

e-mail: radim.dobias@zuova.cz