Využití stanovení klusterinu v séru a likvoru v diagnostice postižení CNS – pilotní studie

Souhrn

V poslední době se objevují informace o možnosti stanovení přítomnosti a rozsahu onemocnění mozku vyšetřením vybraných parametrů v mozkomíšním moku nebo krvi. Jedním z takových potencionálních ukazatelů by mohl být inhibitor apoptózy klusterin.

Cílem práce bylo stanovení diagnostické efektivity vyšetření klusterinu v likvoru a séru u pacientů s onemocněním CNS.

Bylo vyšetřeno 38 probandů. Jedinci byli rozděleni podle přítomnosti postižení CNS z různých příčin na 2 skupiny (bez postižení/s postižením). U všech bylo provedeno CT vyšetření mozku, lumbální punkce s morfologickým a biochemickým vyšetřením likvoru a stanovením indexů albuminu, imunoglobulinů, cystatinu i klusterinu. Osoby se známkami postižení CNS měly koncentrace klusterinu v likvoru a jeho indexu vyšší než probandi bez postižení CNS (mediány klusterinu, resp. indexu Csf/S 5760 vs 3435; p=0,034 vs 0,023; p< 0,01). Byly zjištěny významné korelace mezi klusterinem v likvoru a indexy albuminu (r=0,58; p=0,021), imunoglobulinu G (r=0,66; p=0,008), imunoglobulinu M (r=0,24; p=0,047), imunoglobulinu A (r=0,66; p=0,008) a cystatinem C v likvoru (r=0,43; p=0,022). Po rozdělení pacientů podle přítomnosti onemocnění CNS bylo zjištěno, že stanovení klusterinu v likvoru mělo senzitivitu 79 % a specificitu 86 % při hodnotě klusterinu > 4230 kU/l a senzitivita indexu klusterinu činila 65 % a specificitu 93 % při hodnotě > 0,03 kU/l.

Klusterin se jeví jako slibný laboratorní ukazatel poškození mozkových buněk s uspokojivou diagnostickou efektivitou, který by ev mohl být po ověření těchto údajů ve větších studiích využit i v rutinní diagnostice.

Klíčová slova:
klusterin, index klusterinu, onemocnění mozku, likvor, sérum

Úvod

V posledním desetiletí se stále více diskutuje o diagnostických možnostech laboratorní medicíny při odhadu postižení CNS. Mimo často zmiňovaného stanovení ukazatelů v krvi specifických pro CNS (např. S-100, GFAP) se díky rozvoji standardizovatelných diagnostických prostředků hovoří také o možnostech analýzy mozkomíšního moku na ukazatele spojené s apoptózou, které by měly významně přispět k diagnostice postižení CNS. V poslední době se v tomto kontextu objevily informace o možném využití stanovení koncentrace klusterinu v likvoru v odhadu přítomnosti některých onemocnění CNS. Tento ukazatel se zvýšeně exprimuje v oblastech poškození CNS jako reakce na stres mozkových buněk [1-3]. Jelikož jsou tyto informace ojedinělé, vztažené pouze k vybraným neurologickým diagnózám, a měření klusterinu v likvoru bylo v prezentovaných pracích prováděno pouze v rámci kvalitativních nebo kvantitativních in house metod, stalo se cílem naší práce hledání vztahů mezi koncentrací klusterinu v likvoru a dalšími ukazateli poškození mozkových buněk z různých příčin, resp. odhad, zda-li lze k využít klusterin v likvoru k diagnostice postižení mozku obecně. K tomuto rozhodnutí jsme dospěli díky skutečnosti, že se touto molekulou dlouhodobě zabýváme a díky naší účasti při validačním procesu vůbec první rutinní certifikované komerční soupravy na měření klusterinu.

Metodika

Skupina vyšetřovaných

Byl vyšetřen soubor 38 probandů, pacientů neurologického oddělení Nemocnice Šternberk a neurologické kliniky FN Olomouc. Vyšetřovaná skupina se skládala ze 2 podskupin pacientů.

První podskupinu tvořili pacienti se známkami postižení CNS (n=24; z toho ischemická cévní mozková příhoda n=8; Alzheimrova nemoc n=4, Roztroušená skleróza n=4, serozní zánět CNS n=5, hnisavý zánět CNS n = 3). Druhou podskupinu tvořili jedinci s obtížemi, jako byla zvýšená tělesná teplota, parestezie, bolesti hlavy atp, u kterých se nakonec neprokázalo postižení mozku a šlo o jiný infekt, nekomplikovanou migrénu s normálním neurologickým nálezem, další „neorganické“ bolesti hlavy nebo psychosomatické obtíže (n = 14).

Použité postupy byly v souladu s etickými standardy etické komise Nemocnice ve Šternberku a s Helsinskou deklarací z roku 1975, ve znění revize z roku 1983.

Vyšetřovací metody, zobrazovací diagnostika

Všichni probandi podstoupili vyšetření počítačovou tomografií (jednospirální CT, výrobce Toshiba Asteion). U všech bylo provedeno klinické vyšetření.

Laboratorní vyšetření a technika odběru krve

Odběr na stanovení klusterinu a dalších vyšetřovaných ukazatelů byl proveden z periferní žilní krve, ke stanovení bylo použito séra. Před odběrem nebylo potřeba dodržet žádné speciální dietní nebo režimové opatření nebo lačnit. Vzorek byl po odběru na 60 minut uložen v pokojové teplotě. Poté byla provedena centrifugace (10 min při 1100 g při 4 ⁰C) a část vzorku byla bezprostředně analyzována na stanovení albuminu, cystatinu C, IgG, IgA, IgM, CRP, glukóza, Na, laktát, LD (Advia 1650, Bayer, USA). Druhá část byla zamražena při -80 ⁰C a do 10 týdnů od zamražení byla v sérii změřen u všech osob změřena koncentrace klusterinu (Biovendor, Česká Republika). Analytické charakteristiky metody při verifikaci údajů výrobce byly uspokojivé (opakovatelnost i reprodukovatelnost < 7 %, mez detekce 50 kU/l, linearita i recovery 80-117 %). Na stanovení všech parametrů mimo laktátu bylo použito sérum, na stanovení laktátu citrátová plazma.

Po odběru likvoru byl tento vyšetřen morfologicky a centrigfugován za stejných podmínek jako žilní krev. Z části vzorku byly stanoveny stejně jako v krvi albumin, cystatin C, IgG, IgA, IgM, CRP, glukóza, Na, laktát, LD. Druhá část byla zamražena při -80 ⁰C a do 10 týdnů od zamražení byla v sérii změřen u všech osob změřena koncentrace klusterinu (Biovendor Česká Republika). Analytické charakteristiky metody při verifikaci údajů výrobce byly opět uspokojivé (opakovatelnost i reprodukovatelnost < 9 %, mez detekce 50 kU/l, linearita i recovery 81-121 %).

Z údajů získaných v séru a likvoru byly provedeny výpočty indexů (poměr likvor/sérum), odhad intratekální syntézy imunoglobulinů dle Reibera.

Rozdělení souboru na podskupiny

Pro hodnocení klusterinu v likvoru byl celý soubor rozdělen na podsoubory podle typu diagnózy (jedinci s postižením/bez postižení CNS). Rozdělení na uvedené podsoubory bylo také použito pro sestrojení ROC (receiver operating curve) pro odhad diagnostické efektivity stanovení klusterinu a jeho indexu z hlediska přítomnosti postižení CNS. Vzhledem k rozložení dat klusterinu bylo k ověření údajů ještě použito čtyřpolní tabulky.

Statistické zpracování

Data byla zpracována pomocí software Medcalc (Belgie). Spojité veličiny jsou vyjádřeny jako průměr±směrodatná odchylka a medián, není-li uvedeno jinak. K zjištění souvislostí mezi klusterinem a dalšími ukazateli bylo vzhledem k rozložení dat použito Spearmanova korelačního koeficientu. Hodnoty klusterinu byly mezi oběma skupinami porovnávány vzhledem k rozložení dat pomocí Mann-Whitneyova testu. K ověření diagnostické efektivity klusterinu a jeho indexu pro přítomnost onemocnění CNS bylo využito ROC analýzy a údaje ověřeny vzhledem k rozložení dat sestrojením čtyřpolní tabulky (χ² test). Hodnota p<0,05 byla považována za statisticky signifikantní. Normalita byla hodnocena pomocí Komolgorov-Smirnovova testu.

Výsledky

Data klusterinu v likvoru index klusterinu vykazovala nenormální rozložení (tab. 1). Pouze 11 % vyšetřených pacientů (4 osoby) mělo známky intratekální syntézy imunoglobulinů, přičemž po zpracování v kontingenční tabulce nevyplynula žádná souvislost mezi touto syntézou a hodnotami klusterinu v likvoru (ve všech případech šlo o pacienty s roztroušenou sklerózou).

Po rozdělení skupiny vyšetřených do podskupin podle známek postižení CNS bylo zjištěno, že osoby se známkami postižení CNS měly koncentrace klusterinu v likvoru a jeho indexu významně vyšší než probandi bez postižení CNS (tab. 2, obr. 1). Pro větší přehlednost jsou v tabulce ještě uvedeny hodnoty cystatinu C v likvoru a jeho indexu, které jsou některými autory považovány za potencionální diagnostické ukazatele, nicméně i my sami jsme dříve nepotvrdili možné využití tohoto ukazatele v diagnostice chorob CNS obecně [4]. Tento nález jsme nezávisle potvrdili i v této studii. Pacienti v uvedených skupinách se mezi sebou nelišili v hodnotách věku ani v pohlaví.

Při hledání korelací mezi hodnotami klusterinu, indexem klusterinu a dalšími sledovanými parametry jsme zjistili, že hodnoty klusterinu korelovaly s indexy albuminu (c=0,58; p=0,021), imunoglobulinu G (c=0,66; p=0,008), imunoglobulinu M (c=0,24; p=0,047), imunoglobulinu A (c=0,66; p=0,008) a cystatinem C v likvoru (c=0,43; p=0,022). Nebyly zjištěny souvislosti s indexem CRP ani dalšími měřenými parametry.

Hodnoty klusterinu v séru korelovaly s hodnotami klusterinu v likvoru (c=0,91; p<0,001). Žádné další významné souvislosti s dalšími měřenými ukazateli jsme nenalezli. Z výsledků čtyřpolních tabulek vyplynulo, že existuje jednoznačný důkaz o existenci spojitosti mezi měřitelnou zvýšenou klusterinu i jeho indexu a přítomností onemocnění CNS (tab. 3, tab. 4).

Po rozdělení pacientů podle přítomnosti onemocnění CNS bylo zjištěno, že stanovení klusterinu mělo senzitivitu 79 % a specificitu 86 % při hodnotě klusterinu > 4230 kU/l (pozitivní prediktivní hodnota 91 %, likelihood ratio +5,1, AUC ROC 0,84). Senzitivita indexu klusterinu činila 65 % a specificita 93 % při hodnotě indexu > 0,03 (pozitivní prediktivní hodnota 94 %, likelihood ratio +9,1, AUC ROC 0,84) (obr. 2).

Diskuse

Klusterin (70-80 kDa; synonymum ApoJ) je glykoprotein, který se účastní řady fyziologických i patofyziologických pochodů. Existují dvě formy klusterinu: první forma (sekreční, exogenní) se nachází v biologických tekutinách; druhá forma (endogenní) bývá obsažena v cytoplazmě i jádře [5].

Sekreční forma klusterinu vzniká z preklusterinu (60 kDa), který je následně štěpen na dva řetězce zralého proteinu (α, β). Tato forma má antiapoptotické a antiangiogenetické účinky [5-7].

Endogenní klusterin vzniká alternativním štěpením preklusterinu; výsledná molekula účinkuje naopak jako silný stimulátor apoptózy [5].

Sekreční klusterin působí jako cytoptotektivní extracelulární chaperon, jehož exprese a syntéza bývá zvýšena u pacientů s rozličnými formami stresu, především však u jedinců s maligními nádory [5-8]. Extracelulární klusterin má však také řadu dalších rolí, které zahrnují vazbu a inhibici produkce amyloidu u Alzheimerovy choroby, vazbu abnormálních prionů u Creutzfeld-Jakobovy nemoci, „heat shock proteinů“ či snížení degradace řady komponent extracelulární matrix. Dalšími účinky klusterinu jsou především regulace komplementu, transport lipidů, maturace spermií či ochrana buněčných membrán [5].

Podle všeho má klusterin patofyziologický význam především při vzniku glomerulonefritid, polycystických ledvin, renálních tubulárních onemocnění, chorob CNS (především neurodegenerativních onemocnění), aterosklerózy, infarktu myokardu či maligních chorob [5].

Z uvedeného se nabízí zajímavá možnost detekce onemocnění CNS (stresu buněk CNS obecně) stanovením koncentrace klusterinu v likvoru. Ohledně přítomnosti, resp. diagnostického významu stanovení klusterinu v likvoru se nám podařilo nalézt v literatuře pouze ojedinělé a částečně protichůdné informace [1-3, 5-13]. Některé experimenty potvrdily, že klusterin má v CNS významný cytoprotektivní efekt, vyskytuje ve zvýšené míře ve „stresovaných“ oblastech CNS (např. ischemizovaných lokalitách CNS, při infekci CNS atp) a jeho hodnoty v likvoru bývají u takto postižených jedinců vysoké [1,2,9]. Současně bylo také ověřeno, že klusterin váže rozpustný -amyloid, který se zvýšeně vyskytuje v mozku u Alzheimerovy choroby. Jedinci s tímto postižením mívají v mozku expresi klusterinu a pravděpodobně i vyšší koncentraci tohoto proteinu v likvoru. Toto tvrzení je však na druhé straně v rozporu s výsledky severských autorů, kteří v likvoru nenalezli u pacientů s AD zvýšené hodnoty klusterinu [12].

Jednou z příčin těchto nálezů byla pravděpodobně absence validované soupravy na stanovení klusterinu. V několika málo studiích, které se zabývaly měřením koncentrace klusterinu, bylo použito měření klusterinu pomocí blotovacích technik nebo in house ELISA metod [1-3,9-12]. Navíc i přes to, že byly provedeny i některé studie, které se zabývaly vyšetřením klusterinu v likvoru těmito metodami, nenašli jsme v literatuře informaci, která by shrnula využití stanovení klusterinu v likvoru pro diagnostiku neurologických chorob obecně. Podle našeho názoru jde přitom o ukazatel, jehož potencionální využití je v tomto případě namístě. Díky tomu, že se naše pracoviště mohlo zúčastnit validace pro získání CE značky pro první komerční diagnostickou soupravu na stanovení klusterinu vůbec, rozhodli jsme se vyzkoušet a ověřit efektivitu tohoto stanovení v rutinní praxi.

Naše výsledky potvrdily hypotézy a experimentální zjištění, že jedinci s postižením mozkových buněk mají zvýšený klusterin v likvoru. Pro eliminaci event. chyb při interpretaci výsledků se nám jeví jako vhodnější využití stanovení indexu klusterinu (likvor/sérum), jelikož omezuje falešně pozitivní interpretace při nálezu zvýšených hodnot v likvoru, které jsou způsobeny přechodem klusterinu přes hematolikvorovou bariéru, např. u osob s vysokými hodnotami klusterinu v krvi při infekcích, extremním buněčném stresu, malignitách, atp. Domníváme se, že tato korekce by měla falešně pozitivní výsledky omezit a teoreticky tak poskytnout dostatečně efektivní nástroj na hodnocení přítomnosti postižení CNS.

Závěrem lze konstatovat, že jedinci s onemocněním CNS mají zvýšené hodnoty klusterinu v likvoru. Je možné, že stanovení indexu klusterinu (likvor/sérum) by bylo možno použít k efektivnímu odhadu přítomnosti onemocnění CNS. Tento předpoklad bude však muset být ověřen ve větších studiích u jedinců s různými chorobami CNS za použití standardních certifikovaných diagnostických souprav. Limitací předložené práce je zcela jistě sloučení pacientů s různými formami onemocnění CNS do jedné skupiny. Vzhledem k absenci validních literárních informací o možném využití stanovení koncentrace tohoto ukazatele v diagnostice chorob CNS se však autoři domnívají, že lze tuto práci považovat za pilotní projekt, ze kterého lze čerpat pro následující výzkumy. Cílem autorů nebylo hledat možné patofyziologické souvislosti mezi klusterinem vzhledem k jednotlivým onemocněním mozku, ale na základě experimentálních hypotéz pouze ověřit diagnostickou efektivitu jeho stanovení novou, certifikovanou metodou.

MUDr. David Stejskal, Ph.D

Oddělení laboratorní medicíny Nemocnice Šternberk p.o.

Jívavská 20, 78516, Šternberk

e-mail: david.stejskal@quick.cz

Přijato k recenzi: 28. 2. 2006

Přijato do tisku: 11. 5. 2006