Volné DNA v plazmě a kardiovaskulární medicína – potenciál jejich využití

Souhrn

Výskyt krátkých fragmentů volných DNA (cell-free DNA – cfDNA) jaderného či mitochondriálního původu v tělesných tekutinách je fyziologický. Jejich koncentrace násobně narůstá následkem zranění, zánětu či intenzivní fyzické námahy. Zvýšené koncentrace se rychle vracejí na původní hladiny díky masivní degradaci restrikčními endonukleázami a extenzivnímu katabolizmu v játrech, slezině a částečně i díky vylučování ledvinami. Vyšší koncentrace cfDNA byly popsány v souvislosti s přítomností většiny rizikových faktorů aterosklerózy. Existuje silná korelace mezi cfDNA a koncentracemi kreatinkinázy a troponinu. cfDNA může být použita jako marker cévní mozkové příhody či k rozlišení STEMI a nonSTEMI infarktu myokardu. Mitochondriální cfDNA pak stimuluje zánětlivé procesy. Přestože řada nálezů potřebuje ověřit na rozsáhlejších souborech, cfDNA se mohou v budoucnu stát novými slibnými markery onemocnění a zdravotních prognóz i v kardiologii.

Klíčová slova:

mitochondrie – kardiovaskulární onemocnění – plazma – koncentrace – buněčné jádro – volná DNA

Úvod

S expanzí metodologických možností narůstá i spektrum plazmatických biochemických parametrů, které nacházejí své využití v medicínských aplikacích.

Mezi nové markery lze zahrnout i analýzy volných nukleových kyselin, ať už se jedná o fragmenty DNA nebo o regulační krátké (mikro) RNA. Problematika a potenciál analýz mikroRNA ve výzkumu a v diagnostice patofyziologie aterosklerózy byly v časopise AtheroReview již představeny [1]. V poslední době pak narůstá snaha využít i další nabízející se možnosti, konkrétně analýzy volných jaderných a/nebo mitochondriálních DNA.

Co jsou volné DNA?

Pod pojem volné (extracelulární) cirkulující DNA jsou zahrnuty krátké fragmenty DNA vyskytující se volně v tělesných tekutinách (plazma, moč, sliny aj), a to i za normálních fyziologických podmínek. Nejčastěji jsou analyzovány plazmatické, tzv. cell-free (cfDNA). Ty mohou mít buď jaderný (cell-free nuclear DNA – cfnDNA) nebo mitochondriální (tzv. cell-free mitochondrial DNA – cfmtDNA) původ [2]. Jejich koncentrace se zvyšují např. s věkem, jako odpověď na fyzickou námahu či zranění, a je známo, že jsou ovlivněny i patologickými stavy organizmu [2,3].

Zatímco funkce RNA v plazmě jsou celkem dobře popsány [4]; jedná se především o regulaci genové exprese, aktivní funkce (pokud existuje) cfmtDNA a cfnDNA v plazmě je v detailech neznámá. Předpokládá se, že volné DNA, které jsou aktivně sekretované, hrají roli v mezibuněčné komunikaci.

Meta/katabolizmus cfDNA

Původ a přesný metabolizmus cfDNA ještě nebyl do detailů objasněn. Nicméně, hlavní zdroje cfDNA v organizmu jsou dva [5,6], schéma 1:

1. buňky poškozené nekrózou nebo apoptózou

2. buněčná aktivní sekrece krátkých DNA-fragmentů

DNA-fragmenty sekretované v rámci apoptotických procesů (50–300 kb) nebo následkem akutních zranění či septických stavů (10 kb) jsou řádově delší než při aktivní „běžné“ sekreci. Nicméně, i tyto fragmenty jsou relativně rychle štěpeny endonukleázami a v plazmě se vyskytují především krátké DNA-fragmenty o délce 80–200 párů bazí [4,6]. Jejich biologický poločas je (bohužel) velice krátký, uvádí se v rozmezí 15 až 150 minut [7].

Při analýzách a interpretaci je nutné brát v úvahu, že cfDNA se v plazmě vyskytuje ve 3 základních formách [4]: jako volná (často shlukovaná do di– nebo trimerů), navázaná na extracelulární membránové vezikuly, nebo může být součástí velkých makromolekulárních komplexů. DNA-fragmenty vázané na proteiny jsou touto vazbou chráněny před rychlou degradací endonukleázami.

Koncentrace cfDNA v plazmě je značně variabilní v závislosti na podmínkách a údaje v literatuře se velmi rozcházejí. Za kvalifikovaný odhad lze považovat hodnotu 0,1–100 ng/ml [5], což zhruba odpovídá desítkám až tisícům kopií v mililitru pro jadernou cfDNA a desítkám až stovkám tisíc kopií v mililitru pro mitochondriální cfDNA.

Výhodou analýz cfDNA je snadnost získání vzorku z žilní krve (atraktivně nazývaná jako liquid biopsy) [3] a rychlost a heterogenita možných analýz primárně založených na aplikacích využívajících řetězovou polymerázovou reakci [3]. Nevýhodou pak je nutnost vzorky zpracovat relativně rychle po odběru, aby se zamezilo uvolňování DNA z jaderných krevních buněk a případnému zkreslení výsledku.

Jak již bylo zmíněno výše, plazmatická DNA je velice rychle degradována restrikčními endonukleázami. Krátké fragmenty cfDNA jsou z plazmy odstraňovány primárně v játrech (přibližně z 80 %), ve slezině a méně významnou cestou clearance cfDNA jsou i ledviny [8].

cfDNA v oblastech mimo kardiologii

Analýza cfDNA je využívána v řadě medicínských oborů (schéma 2). Výrazně se rozšířila v onkologických aplikacích, a to především díky skutečnosti, že nádorová tkáň uvolňuje do oběhu tumor-specifickou DNA [9,10] a kvalitativní analýza cfDNA je mnohem snadnější a přesnější než analýza kvantitativní.

Vysoké koncentrace cfDNA jsou spojeny s horší prognózou u septických stavů [11] i u pacientů s těžkými traumaty [12].

V transplantologii je intenzivně zkoumáno potenciální využití detekce dárcovské (uvolněné z tkáně transplantovaného orgánu) cfnDNA a cfmtDNA v plazmě příjemce jako markeru akutní rejekce štěpu [13–15]. Prenatální diagnostika pak využívá fetální cfDNA k včasné diagnóze genetických onemocnění a preeklampsie [16,17] a ve sportovní medicíně jsou cfDNA markerem adaptace na zátěž, případně přetrénovanosti [18].

Konečně, je nutné zmínit i výskyt bakteriální či virové cfDNA/RNA v plazmě, která může být využita pro detekci a diagnostiku probíhajícího infekčního onemocnění [19]. Analýza cfDNA nachází uplatnění i v tak zdánlivě vzdálených oblastech lidského zdraví, jako je kosmonautika [20].

cfDNA v kardiologii

V posledních letech bylo publikováno několik prací ukazujících, že analýza cfDNA může být užitečným markerem i v kardiologii. „Módnost“ tématu se ale odráží ve faktu, že počet publikovaných „review“ a „opinion papers“ je výrazně vyšší než počet klinických výsledkových publikací. Ty navíc, bohužel, ne vždy zahrnují dostatečně vysoké počty vyšetřených jedinců, a k přímému klinickému využití analýz cfDNA tak zbývá ještě dlouhá cesta.

Byly popsány korelace mezi koncentrací cfDNA a několika rizikovými faktory aterosklerózou podmíněného kardio­vaskulárního onemocnění (ASKVO), někdy s překvapivými závěry. Je zajímavé, že kuřáci s onkologickým onemocněním mají oproti očekávání nižší hladiny cfDNA na rozdíl od stejně nemocných nekuřáků [21]. U zdravých osob platí obrácený vztah – kouření zvyšuje hladiny jak cfnDNA, tak cfmtDNA [22]. V případě ostatních rizikových faktorů jsou s jejich přítomností spojeny zvýšené hladiny cfDNA.

Výsledky studie The Health 2000 Survey [23] ukázaly na relativně slabé, ale významné pozitivní korelace mezi koncentrací cfDNA a systolickým krevním tlakem, triglyceridy a zánětlivými parametry (CRP a IL6), a to jak u mužů, tak u žen. Za zmínku stojí, že koncentrace cfDNA byly o necelých 10 % nižší u žen užívajících hormonální substituční terapii oproti ženám bez této terapie.

U pacientů s plicní hypertenzí byla popsána zvýšená koncentrace cfnDNA [24], ta navíc výrazně korelovala s přežitím pacientů bez nutnosti transplantace plic.

Již v roce 2006 [25] byla prokázána silná korelace mezi koncentracemi kreatinkinázy a troponinu a cfDNA. Koncentrace cfDNA byly asi o 50 % vyšší u pacientů s akutním infarktem myokardu než u kontrol a byly spojeny s horší prognózou onemocnění. Později bylo prokázáno (pomocí analýzy metylačního statusu cfDNA), že tato cfDNA má zdroj (nikoli však výhradní) v apoptózou postižených kardiomyocytech [26,27], a je tedy uvolňována po infarktu. Analýza metylačního statusu byla dokonce použita pro charakteristiku odlišných typů akutního koronárního syndromu (primárně akutní infarkt myokardu s elevacemi ST-úseku – STEMI vs nonSTEMI) [28]. Je zajímavé, že v tomto případě měla nejvyšší vypovídající úlohu cfDNA pocházející z ledvin. Konečně, analýza přežívání u pacientů se srdečním selháváním popsala nadprůměrné hladiny cfDNA jako nejsilnější faktor predikující mortalitu [29].

U pacientů s cévní mozkovou příhodou byly rovněž popsány zvýšené koncentrace cfDNA, ty navíc korelovaly i s rozsahem tkáňového poškození [30].

Volná DNA ale nemusí být pouze markerem cévních onemocnění. Bylo prokázáno, že především cfmtDNA má i prozánětlivé účinky [31].

Závěr

Volné extracelulární DNA se mohou stát novými slibnými markery onemocnění a najít využití v diagnostice a monitoringu progrese onemocnění i v kardiologii. Nelze ale vyloučit, že cfDNA jsou podobně jako miRNA i molekulami aktivně zasahujícími do různých patologických procesů. Jejich širšímu diagnostickému využití poněkud brání především intra– i interindividuální variabilita jejich koncentrací a rychlost jejich katabolizmu.

Podpořeno projektem MZ ČR č. NU21–01–00146. Všechna práva vyhrazena.