Hodnocení exprese antigenu CD45 u pacientů s mnohočetným myelomem a jeho vliv na dobu do první progrese nebo relapsu

Mnohočetný myelom (MM) je jedním z nejčastějších hematoonkologických onemocnění s variabilním agresivním i indolentním chronickým průběhem. Prognostická stratifikace se dále upřesňuje s vývojem nových metodik hlavně v cytogenetice a průtokové cytometrii. Antigen CD45 by mohl být jedním ze znaků, které mohou upřesnit rizikovost nemoci již při diagnóze. 71 pacientů v našem souboru bylo rozděleno podle intenzity exprese CD45 antigenu a skupina s nižší expresí měla statisticky vyšší riziko relapsu do 12 měsíců 62 % vs. 25 % (p = 0,0011). Mezi porovnávanými skupinami nebyl statisticky významný rozdíl s ohledem na věk, zastoupení pohlaví, intenzifikaci s autologní transplantací krvetvorných buněk, dosažení kompletní remise po první linii léčby a genetické nálezy. Na základě našich poznatků se domníváme, že exprese CD45 antigenu by se mohla stát jedním z prognostických faktorů či jedním z faktorů pro určení udržovací léčby u MM. Ověření je vhodné na větším souboru pacientů, ideálně v rámci multicentrické spolupráce.

Klíčová slova:
mnohočetný myelom, plazmocyty, průtoková cytometrie, cytogenetika, CD45, doba do progrese (TTP)

Úvod

Mnohočetný myelom (MM) je poměrně časté onemocnění se zastoupením až 15% v rámci hematologických malignit a až 1% v rámci všech nádorových onemocnění. Incidence MM se pohybuje v rozmezí 1–4 osob/100 000 obyvatel ročně, ve věkové kategorii 75–79 let je však incidence této nemoci až 16 osob//100 000 obyvatel (8). Častěji postihuje muže a je častější u Afroameričanů (1). Onemocnění je charakterizované klonální proliferací maligně transformovaných plazmatických buněk s produkcí monoklonálního imunoglobulinu – paraproteinu. Od konce minulého století se začala v detekci plazmatických buněk uplatňovat také průtoková cytometrie (flow cytometry; FACS). Všechny plazmatické buňky exprimují na svém povrchu znak CD38, přičemž zralé maligní plazmocyty mohou tento znak exprimovat s nižší intenzitou než fyziologické, zralé. Naopak znak CD138 je přítomen u obou populací stejně. Odlišení mezi těmito dvěma skupinami je možné pomocí znaků CD19 a CD56, kdy zdravé plazmatické buňky jsou CD19+CD56- a zralé myelomové buňky naopak CD19-CD56+. Dále u myelomových buněk bývají exprimovány znaky CD117 a CD20 (2, 3). Z posledních výzkumů se ukazuje, že ztráta exprese CD20 znaku je spojena s agresivnější nemocí (4). Pro potvrzení klonality plazmatických buněk je nutno ještě analyzovat expresi lehkých řetězců kappa a lambda – v případě reaktivního procesu se jedná o polyklonální stav, kdy jsou přítomny oba lehké řetězce. Naopak při nádorovém onemocnění jde o monoklonální proces – je přítomen pouze jeden z těchto řetězců, neboť každá imunokompetentní B buňka produkuje jen jeden typ imunoglobulinu (5).

Povrchový antigen CD45 neboli Protein tyrosin fosfatáza, receptor typu C, je klíčovým regulátorem antigen-zprostředkované signalizace a aktivace lymfocytů. CD45 má kontrolní vliv na interleukin 6 a růstový faktor 1 podobný inzulinu (insulinlike growth factor 1) (14), což jsou faktory, které mají klíčovou úlohu pro růst, transformaci a apoptózu buněk. Za normálních okolností mladé plazmatické buňky tento znak exprimují, ale v průběhu diferenciace a vyzrávání jej ztrácí. Naopak plazmatické buňky CD45 negativní více odolávají apoptóze a tím i méně reagují na léčbu (6). Podle dostupných dat by měla být nízká exprese CD45 nepříznivým faktorem ovlivňující časnost progrese (7).

Ve snaze ověřit význam antigenu CD45 na prognostické stratifikaci u pacientů s MM jsme se rozhodli provést následnou analýzu souboru našich nemocných.

Materiál a metodika

Retrospektivní analýza pacientů s MM s cílem porovnat dobu do první progrese/relapsu (TTP) s ohledem na expresi CD45 znaku ve skupině s nízkou expresí „dim“ oproti skupině s vyšší expresí „bright“ (viz obrázek 1). Analyzovaný soubor tvořilo celkem 71 pacientů s mnohočetným myelomem nově diagnostikovaným v období 5/2011 až 12/2012 na našem pracovišti. Medián věku pacientů byl 58 (38–72) let. U všech pacientů byla zahájena indukční léčba s podáním 4 cyklů chemoterapie většinou s použitím nových léků (protokoly CTD, CVD, RD, VD, VMP) (8), pouze u 4 pacientů (5 %) se jednalo o protokoly bez použití nových léčiv a celkem 62/71 (87 %) pacientů dále podstoupilo cyklus vysoko dávkované chemoterapie s melfalanem a autologní transplantací periferních krvetvorných buněk. Pouze u 12 % pacientů autologní transplantace nebyla provedena buď z důvodu věku, nebo z důvodu špatné mobilizace periferních buněk. Vyšetření kostní dřeně včetně vyšetření cytogenetického a průtokovou cytometrii pro naše sledování bylo provedeno vstupně v době diagnózy. Charakteristiky souboru jsou dále uvedeny v tabulce 1.

TTP byla definována jako doba od ukončené indukční léčby do první progrese/relapsu. TTP od ukončené léčby nikoliv od zahájení léčby jsme zvolili z důvodu lepší dostupnosti a validity dat z období ukončené léčby. Poměrná část pacientů totiž pocházela ze spádových nemocnic a validita výsledků byla velmi rozdílná, od ukončení indukční léčby byla většina pacientů již léčena v našem centru. Diagnostika MM vycházela z kritérií IMWG (8). U pacientů bylo vstupně a dále ve velké části případů i po ukončení indukční léčby provedeno vyšetření kostní dřeně – morfologické, cytologické, FACS a cytogenetické vyšetření. Detekce přítomnosti paraproteinu byla hodnocena v lokální certifikované laboratoři s využitím metodiky elektroforézy a imunofixace.

Dosažení léčebných odpovědí bylo definováno podle standardních kritérií IMWG (8) zahrnujících ve stručnosti: Kompletní remise (CR) – nepřítomnost původního M-proteinu v séru a moči imunofixací, méně než 5 % plazmocytů v kostní dřeni, nepřítomnost extraoseálního nádoru, žádná nová osteolytická nebo narůstající ložiska. Parciální remise (PR) a velmi dobrá parciální remise (VGPR): pokles M-proteinu a regrese plazmocytomových mas měkkých tkání o nejméně 50 % (v případě VGPR pokles nejméně o 90 %) a žádná nová nebo narůstající osteolytická ložiska. Minimální odpověď (MR): pokles M-proteinu a regrese plazmocytomových mas měkkých tkání o 25–49 %, žádná nová nebo narůstající osteolytická ložiska. Relaps: nová aktivita nemoci (infiltrace dřeně, M-protein, extraoseální tumor) po předchozí CR. Progrese: nárůst aktivity o 25 % (M-protein, infiltrace dřeně, tumor) po předchozí PR nebo MR.

Po ukončení první linie léčby byly vyšetřovány hladiny M-proteinu v séru a moči elektroforézou a imunofixací v cca 3měsíčních intervalech po ukončení léčby.

Průtoková cytometrie. Na stanovení imunofenotypu plazmatických buněk byla použita kombinace značení povrchových a intracytoplazmatických znaků. Pro detekci povrchových znaků bylo 100 µl kostní dřeně inkubováno 15 min ve tmě při pokojové teplotě s monoklonálními protilátkami: CD45Horzion V500 (BD Bioscicence, USA), CD28-FITC, CD20-Pacific Blue, CD8-PerCP (vše Exbio, ČR), CD117-PE, CD138-APC, CD38-APC-AF750 (vše Immunotech, USA) a CD45-HorizonV500 (BD Bioscience, USA), CD56-Pacific Blue (Exbio), CD19-PE-Cy7, CD138-APC, CD38-APC-AF-750 (Immunotech). U první zkumavky byly po inkubaci lyzovány erytrocyty pomocí komerčního roztoku BD FACS Lysing Solution (BD Bioscenece) s následným promytím PBS (fyziologický roztok s fosfátovým pufrem) a centrifugací. Po centrifugaci byl odstraněn supernatant a peleta byla rozvolněna v 0,5ml PBS. U druhé zkumavky byly buňky s povrchovým značením nejprve fixovány, promyty PBS a poté byla provedena permeabilizace a intracytoplazmatické barvení lehkých řetězců s vy-užitím polyklonálních protilátek. Pro fixaci povrchových znaků a následnou permeabilizaci byl použit komerční kit IntraPrep (Immunotech). Měření bylo provedeno na průtokovém cytometru BD FACSCanto II s využití software BD FACSDiva. Identifikace plazmocytů proběhla sekvenčním značením pomocí kombinace antigenů CD38, CD138, CD45 v lokalitě typické pro plazmocyty (scatter vlastnosti) a podle znaků CD19 a 56 jsme odlišili atypické (CD19-, 56+) a normální plazmocyty (CD19+, 56-). Pro detekci minimálního zbytkového onemocnění (minimal residual disease; MRD) byl limit senzitivity 0,01 % (10^e-4).

Genetické analýzy. Cytogenetická vyšetření a jejich výsledky byly dostupné u 63/71 (89 %) pacientů. Specificky byl sledován výskyt prognosticky nepříznivých změn (9) v podobě komplexních aberací karyotypu, delece 17p (resp. delece genu TP53), t(4;14)(p16;q32) a t(14;16)(q32;q23). Buňky kostní dřeně byly pro cytogenetické vyšetření kultivovány 24 hodin v médiu bez stimulace specifickými mitogeny. Pro analýzu chromozomů byla použita metoda G-pruhování. Cytogenetická analýza byla prováděna dle mezinárodních doporučení pro mnohočetný myelom a výsledek byl zapsán dle ISCN 2013 nomenklatury. Metoda FISH (fluorescenční in situ hybridizace) byla prováděna s plazmocyty imunologicky značenými pro specifickou analýzu patologických buněk (cIg-FISH). Byly používány komerčně dostupné FISH sondy od firem Abbott a Kreatech dle návodů daných výrobcem.

Statistické zpracování. Provedeno s využitím programu GraphPad InStat-Statistica Software a základních statistických testů – Mann-Whitney, Fisher‘s Exact Test a t-test. Křivky pravděpodobnosti progrese a TTP byly zpracovány metodikou podle Kaplana a Meiera a vyhodnocení významnosti statistických rozdílů bylo provedeno log-rank testem (software MedCalc). Rozdíly mezi skupinami byly testovány na hladině 95% významnosti a hodnoty p < 0,05 byly považovány za staticky významné rozdíly.

Výsledky

Analyzovaný soubor tvořilo celkem 71 pacientů s ukončenou 1. linií léčby. Byly porovnány skupiny pacientů s nízkou „dim“ (n = 25) a vyšší „bright“ (n = 46) expresí CD45 antigenu. K 1/2014 žije 51/71 (72 %) pacientů, 20/71 (28 %) zemřelo, obě skupiny s mediánem doby sledování 18 (8–44) vs. 22 (1–107) měsíců (p = 0,08).

Nebyl zjištěn statisticky významný rozdíl s ohledem na věk – medián 58 (38–67) vs. 62 (40–72) let (p = 0,30), zastoupení pohlaví – poměr muži/ženy 13/12 vs. 24/22 (p = 1,0), výskyt nepříznivých genetických aberací 7/25 (28 %) vs. 9/46 (20 %) (p = 0,57), výskyt 3. stadia dle ISS 14/25 (56 %) vs. 20/46 (44 %) (p = 0,67), dosažení kompletní remise po 1. linii léčby 5/20 (20 %) vs. 13/39 (29 %) (p = 0,78), četnost autologní transplantace 23/25 (92 %) vs. 39/46 (85 %) (p = 0,86) – viz také údaje v tabulce 1.

Při srovnatelném mediánu sledování u obou skupin byla pravděpodobnost progrese ve 12 měsících 62 % ve skupině „dim“ vs. 25 % ve skupině „bright“ a medián TTP byl 10 vs. 20 měsíců (p = 0,0011) – viz obrázek 2.

Diskuse

Mnohočetný myelom je malignita s velmi variabilním, ale často agresivním průběhem. Míru jeho agresivity a léčebné výsledky lze do určité míry předpokládat s využitím prognostických stratifikací, systémů a markerů, kde mezi nejvýznamnější patří stadium dle ISS (10) a genetické aberace s významnou rizikovostí v podobě komplexních aberací, delece 17p (resp. delece genu TP53), t(4;14) a t(14;16) (9). Poměrně zajímavým a jednoduše detekovatelným markerem prognózy u MM by mohla být exprese antigenu CD45 na povrchu patologických plazmocytů, jak uvádějí Moreau et al. a další (7, 11, 13), který dává nízkou expresi CD45 do souvislosti s časnější progresí myelomu. Jelikož znak CD45 se podílí především na apoptóze a transformaci buněk (12), je tak pravděpodobné, že právě nízká exprese tohoto znaku způsobuje u plazmocytů vyšší odolnost vůči apoptóze, a tím i menší odolnost k léčbě. Z toho vyplývá, že pacienti s negativitou CD45 budou více ohroženi časným relapsem či progresí nemoci bez vlivu na dosažení stavu remise po indukční terapii. Pokud porovnáme citace z dostupné literatury, tak ve většině textů (7, 11, 12, 13) se autoři shodují na vlivu nízké exprese CD45 na rizikovost nemoci, ale u některých autorů (12) není statistická signifikance tak výrazná. Jelikož je stanovení pomocí průtokové cytometrie poměrně rychlé a snadné, je nutné o významu vyšetření tohoto markeru uvažovat. Je pravda, že maximální využívání FACS parametrů u jiných hematoonkologických nemocí se dnes již dostává do pozadí (např. znaky CD38 a ZAP70 u CLL, které byly dříve velmi vyzdvihovány jako jednoznačné prognostické znaky, se dnes ukazují jako ne úplně vypovídající o rizikovosti nemoci) (15). Ale na druhou stranu nutno vzít v potaz, že u mnohočetného myelomu je doba přežívání výrazně kratší než třeba u zmiňované CLL a právě proto je i snaha o co nejsnadnější stratifikaci nemoci důležitá. Za úvahu do budoucna stojí využití znalosti exprese CD45 znaku například u udržovací terapie. Při teorii znalosti rizikovosti exprese znaku CD45 by byli například pacienti s MM s nízkou expresí CD45 indikováni časně k udržovací terapii již v první linii po autologní transplantaci. Nabízí se i konsolidační terapie po autologní transplantaci u těchto rizikových pacientů. Pro jasný názor však zatím chybí relevantní data.

Cílem naší práce bylo porovnat dobu do progrese/relapsu (TTP) u našich pacientů s MM s ohledem na expresi CD45 znaku s údaji udávanými v dostupné literatuře. Porovnali jsme početně poměrně dobře zastoupené skupiny pacientů s nízkou a vyšší expresí CD45. Mezi skupinami nebyl pozorován statisticky významný rozdíl v demografických parametrech, rizikovosti cytogenetiky ani efektu 1. linie léčby. Soubor s nízkou expresí CD45 měl významně kratší TTP, což odpovídalo i datům původní práce Moreau et al. (7). Velmi zajímavé bylo, že v obou skupinách nebyl signifikantní rozdíl v zastoupení negativních cytogenetických nálezů (tzn. nepříznivé nálezy – komplexní aberace karyotypu, delece 17p (resp. delece genu TP53), t(4;14) a t(14;16)), které se obecně u MM považují za jeden z nejdůležitějších prognostických kritérií. V obou skupinách byly srovnatelně zastoupeny jak nepříznivé cytogenetické změny, tak normální karyotyp a také příznivé cytogenetické nálezy. Naše výsledky byly tedy podobné jako v publikaci Moreau et al. Limitací našeho sledování byl především retrospektivní charakter a unicentrická lokalizace. V případě většího zastoupení pacientů a spolupracujících center by výsledky mohly být ještě více validní. Nicméně na druhou stranu je v našem případě zajištěna uniformní metodika a nastavení analýzy průtokové cytometrie.

V závěru, na základě našich nálezů a zkušeností Moreau et al. (7), se domníváme, že exprese CD45 antigenu by se mohla stát jedním z prognostických faktorů MM. Náš soubor byl homogenní, početný a všechna vyšetření průtokovou cytometrií byla prováděna v jedné laboratoři. Ověření našich výsledků by bylo vhodné provést na větším souboru pacientů, ideálně v rámci multicentrické spolupráce, navíc výhodné pro porovnání výsledků dosažených jednotlivými centry.

Poděkování

Nadace pro transplantace kostní dřeně – grant na úhradu laboratorních reagencií.

Podíl autorů na přípravě rukopisu

AJ: hlavní autor, sepsání rukopisu, zpracování dat

SV: podíl při psaní rukopisu, rozšíření diskuse, hlavní korekce

MH, DL: metodika průtokové cytometrie

PD: metodický popis cytogenetiky

PJ: komplexní korekce, podněty k diskusi

Doručeno do redakce: 26. 2. 2014

Přijato po recenzi: 4. 4. 2014

MUDr. Alexandra Jungová

Hematologicko-onkologické oddělení

Fakultní nemocnice Plzeň

alej Svobody 80

304 60 Plzeň-Lochotín

e-mail: jungovaa@fnplzen.cz