PICSI – selekce zralých spermií pro oplození lidských oocytů metodou ICSI

Overview

Cíl práce:
PICSI (Preselected Intracytoplasmic Sperm Injection) využívá možnosti vybrat k oplozování oocytů metodou ICSI (Intracytoplasmic Sperm Injection) zralou spermii na základě její schopnosti vázat se na hyaluronan. Receptor, který umožňuje tuto specifickou vazbu, je vytvořen na hlavičce zralé spermie. Cílem práce bylo zjistit, zda použití selektovaných spermií zlepší úspěšnost léčby.

Materiál a metodika:
Selekce spermií se provádí na speciální misce se třemi mikrokapkami hyaluronanu, na které se naváží zralé spermie. Po inkubaci jsou pomocí mikromanipulační pipety tyto spermie vybrány a použity k oplozování vajíček metodou ICSI.

Výsledky:
Oplozování oocytů pomocí PICSI bylo provedeno u 40 pacientek, procento oplození bylo 93,4 % oproti dlouhodobému průměru 89,2 % při ICSI bez selekce spermií. Z 38 transferů bylo dosaženo 21 klinických těhotenství, pregnancy rate (PR) 55,3 % oproti standardní metodě ICSI s dlouhodobým průměrem PR 38,2 %.

Závěr:
PICSI je perspektivní metodou pro zlepšení výsledků ICSI.

Klíčová slova:
ICSI – PICSI – spermie – neplodnost – hyaluronan

Úvod

Provedení analýzy spermatu před zpracováním pro oplození oocytů spočívající ve stanovení koncentrace, pohyblivosti a morfologie spermií neposkytuje informaci o schopnosti spermií oplodnit oocyt. Nezískáme informaci o dalších aspektech, jako je zralost jádra, integrita chromatinu, schopnost vazby spermie na oocyt. Relativně dobrý spermiogram nezaručuje oplození oocytu a zdárný vývoj embrya. Nehledě k faktu, že při in vitro fertilizaci je třeba oplozovat oocyty takovým spermatem, který je k dispozici a který velmi často nesplňuje ani hranici normy. Při obvyklých postupech ICSI jsou spermie pro injekci selektovány vizuálně na základě jejich morfologie a pohyblivosti. Metodou PICSI je v každém případě vybrána kvalitnější spermie, než by byla vybrána náhodně.

PICSI využívá možnosti selekce zralých spermií na základě jejich schopnosti vázat se k hyaluronanovému hydrogelu, neboť pouze hlavička zralé spermie nese receptor, který tuto vazbu umožňuje [1]. Kyselina hyaluronová je hlavní komponentou cumulus oophorus – vrstvy buněk obklopující oocyt. Chemicky se jedná o polypeptid tvořený z opakujících se jednotek N-acetylglukozaminu a kyseliny glukuronové (obr. 1). Při oplození je z akrozomu spermie uvolňován mimo jiné enzym hyaluronidáza, který rozrušuje spoje buněk corona radiata a umožňuje vazbu spermie k zona pellucida. Bylo prokázáno, že spermie selektované touto technikou jsou viabilní, bez retence cytoplazmy, mají nižší fragmentaci DNA a nižší markery apoptózy [2]. Protože zralé spermie mají výrazně nižší výskyt chromozomálních aberací, je tato metoda považována za efektivnější ve smyslu úspěšnosti oplodnění. Cílem této práce bylo zjistit, zda takto selektované spermie zvýší procento oplozených oocytů, kvalitních embryí a dosažených klinických těhotenství. 

Materiál a metodika

Metoda PICSI byla provedena u pacientek našeho Centra asistované reprodukce, kterým byla doporučena buď na základě dřívějších neúspěšných cyklů po transferu embryí, nebo z důvodu velmi nízké kvality spermatu.

Spermie jsou po zhodnocení spermiogramu dle WHO [3] připravovány pro oplození. Zpracování probíhá buď standardní metodou centrifugace a swimm-up (Sperm Preparation Medium, Origio), nebo použitím SupraSperm média (Origio) pro izolaci živých spermií metodou hustotního gradientu. Po vycestování spermií z peletky na dně zkumavky do 200 µl navrstveného média (Universal IVF Medium, Origio) jsou spermie připraveny pro použití (obr. 2). Miska pro PICSI (PICSI^® Sperm Selection Device MidAtlantic Diagnostics, Inc.) je polystyrenová kultivační miska se třemi mikrokapkami hyaluronanu přichycenými na vnitřní stranu dna misky. Kapky jsou pro zviditelnění označeny liniemi na vnější straně dna misky (obr. 3). Hyaluronové mikrokapky je třeba před přidáním spermií nejdříve hydratovat médiem, což způsobí nabobtnání gelu a umožní vazbu spermií. Nabobtnání a vazba spermií začne v normálním případě do 5 min. nebo dříve, starší mikrokapky potřebují pro dosažení plné vazebné kapacity hydratovat 30 min i déle. Správnou hydrataci poznáme tak, že hydrogel nabobtná a dojde k vazbě spermií. Hodnotíme po 5 min, a pokud je málo vázaných spermií, necháme inkubovat déle. Zralé spermie rozpoznají strukturu hyaluronanu a navážou se na něj. Poznáme je tak, že nevykazují progresivní pohyb ani při intenzivním pohybu bičíku. Pomocí mikromanipulační pipety jsou následně tyto spermie nasáty, přeneseny do samostatné kapky média v dostatečném počtu dle počtu připravených oocytů a použity k injekčnímu vpravení do cytoplazmy metodou ICSI (obr. 4). 

Výsledky

Od července do konce října 2010 podstoupilo na našem pracovišti oplození oocytů pomocí PICSI 40 pacientek. Oplozováno bylo 152 MII oocytů, průměr na jednu pacientku 3,8 oocytů (1–12). Ve 34 případech (85,0%) byl spermiogram pod hranicí normy buď ve všech, nebo alespoň jednom parametru – koncentrace spermií (mil/ml), procento pohyblivých spermií, morfologie. U devíti párů se jednalo o první cyklus léčby, v případě jedné pacientky to byl již 7. léčebný cyklus. Oplození bylo dosaženo u 142 oocytů (FR 93,4%) oproti dlouhodobému průměru 89,2% při ICSI bez selekce. Transfer embryí byl proveden u 38 pacientek, přičemž u 21 z nich bylo dosaženo těhotenství (PR 55,3%). U standardní metody ICSI je dlouhodobě dosahováno PR 38,2% (graf 1).

Diskuze

Použití hyaluronanu k selekci spermií je bezpečná metoda, neboť hyaluronan se normálně nachází v ženském repro­dukčním traktu a v cumulus oophorus. Je tedy pravděpodobné, že se hyaluronan dostává do oocytu se spermií dokonce i při in vivo koncepci. Při výběru spermie navázané na hyaluronan mikromanipulační pipetou je možné, že několik molekul hyaluronanu zůstane přichycených ke spermii, nebo že několik čtverečných mikrometrů membrány spermie zůstane přichyceno k hyaluronanu. V každém případě se fertilizace takto selektovanou spermií neliší od přirozené fertilizace [2]. Dle našich zkušeností nemá metoda na fertilizaci žádný negativní vliv.

Očekávaná výhoda PICSI spočívá v tom, že u spermií selektovaných pomocí hyaluronanu je frekvence chromozomálních disomií a diploidií v normálním rozmezí, a to nezávisle na frekvenci aneuploidií v počátečním spermatu. V tomto ohledu jsou tedy vlastnosti hyaluronanu podobné vlastnostem zona pellucida. Bylo prokázáno, že takto selektované spermie jsou životaschopnější, zbavené histonů a bez apoptózy [4,5]. Paternální přínos těchto „kvalitnějších“ spermií by měl vést ke snížení výskytu potratů.

Vazba zralých spermií může také souviset s poškozením jejich membrán v souvislosti s oxidačním stresem [6,7]. Studie mohou v tomto směru přinést zajímavé výsledky.

Přesto, že se jedná o malý soubor, výsledky procenta oplozených oocytů i dosažených klinických gravidit nás vedou k závěru, že selekcí spermií metodou PICSI lze dosáhnout lepších výsledků v oplození oocytů, vývoji embryí a vyššího pregnancy rate. Při ICSI je obejita normální interakce spermie – oocyt, kde cumulus oopho­- rus a zona pellucida tvoří přirozenou bariéru pro nezralé spermie. Proto lze PICSI doporučit vždy při nízkých hodnotách spermiogramu, kde je indikována ICSI.

Závěr

PICSI je perspektivní metodou pro zlepšení výsledků ICSI. Lze ji doporučit v případě nízkého počtu oplozených oocytů, nedostatečného vývoje embryí v předchozích výkonech a v případě opakovaných těhotenských ztrát.

Studie byla podpořena grantem IGA MZ ČR NS/9661-4. 

Doručeno do redakce: 11. 11. 2010

Přijato po recenzi: 18. 11. 2010

RNDr. Jana Žáková, Ph.D.

Ing. Eva Lousová

doc. MUDr. Igor Crha, CSc.

prof. MUDr. Pavel Ventruba, DrSc.

doc. MUDr. Michal Pohanka, Ph.D.

Petra Nentwichová

Hana Pochopová

Gynekologicko–porodnická klinika LF MU a FN Brno

jzakova@fnbrno.cz