Klinický význam a možnosti detekce mikrometastáz u dlaždicobuněčného karcinomu hlavy a krku

Overview

Přítomnost či nepřítomnost detekovatelných krčních metastáz je v současnosti považována za jeden z nejvýznamnějších prognostických faktorů u dlaždicobuněčného karcinomu hlavy a krku, zejména u HPV negativních nádorů. V rámci terminologie metastatického postižení krčních uzlin je však nutné důsledně rozlišovat mezi makrometastázami, okultními metastázami, mikrometastázami a izolovanými nádorovými buňkami (ITC). Zatímco prognostický vliv průkazu ITC v lymfatické uzlině zůstává nejasný, nález mikrometastáz lze považovat za klinicky významný. Mikrometastázy a ITC nejsou detekovatelné běžnými klinickými diagnostickými metodami a nemusí být zjištěny ani standardním histologickým vyšetřením. K jejich průkazu jsou nejčastěji využívány imunohistochemické a molekulárně genetické metody. Jelikož lze v případě mikrometastáz očekávat další růst nádorové tkáně, je vhodné doporučit provedení elektivní krční disekce u nádorů s vyšší tendencí k tvorbě mikrometastáz.

Klíčová slova:
krční metastázy, mikrometastázy, izolované nádorové buňky

ÚVOD

Zatímco význam klinicky zjistitelných krčních metastáz dlaždicobuněčného karcinomu je v literatuře dobře dokumentován, význam mikrometastáz či dokonce tzv. izolovaných nádorových buněk v lymfatické uzlině zůstává zatím nejasný. Přítomnost či nepřítomnost detekovatelných krčních metastáz je v současnosti považována za jeden z nejvýznamnějších prognostických faktorů u dlaždicobuněčného karcinomu hlavy a krku, zejména u HPV negativních nádorů. K dalším významným faktorům patří počet postižených lymfatických uzlin, počet postižených krčních oblastí, velikost metastáz, lokalita postižených lymfatických uzlin a makroskopické či mikroskopické známky extrakapsulárního šíření nádoru (4).

DEFINICE A KLASIFIKACE KRČNÍCH METASTÁZ

• Makrometastázy

Za makrometastázu bývá považována zvětšená krční uzlina, která je zřejmá klinicky při fyzikálním vyšetření nebo radiologicky pomocí zobrazovacích technik.

• Okultní, subklinické metastázy

Pojem okultní, případně subklinické metastázy, označuje klinicky či radiologicky nedetekovatelné postižení krčních uzlin. Část okultních metastáz může být zjištěna běžným histopatologickým zpracováním, tedy standardními řezy a světelnou mikroskopií při barvení hematoxylinem a eozinem. Další případy představují malá nádorová depozita, která mohou uniknout diagnostice při rutinním histologickém zpracování, při kterém se lymfatická uzlina nevyšetřuje v celém rozsahu. Tato depozita jsou označována jako mikrometastázy nebo také subpatologické metastázy (4).

• Mikrometastázy

V ORL literatuře až donedávna scházelo přesné vymezení pojmu mikrometastáza. Řada autorů se lišila v určení horní hranice velikosti mikrometastáz, přičemž udávaná hranice se pohybovala nejčastěji mezi 1–3 mm (4). V roce 2007 proto Devaney (2) doporučil používat pro krční mikrometastázy stejnou klasifikaci jako pro karcinom prsu, pro který platí, že za mikrometastázu jsou považována ložiska nádoru v lymfatické uzlině od 0,2 mm do 2 mm. Autor současně s UICC (Union Internationale Contre le Cancer) a AJCC (American Joint Committee on Cancer) doporučil označovat nádorová depozita velikosti 0,2 mm a menší jako izolované nádorové buňky. Tomuto doporučení odpovídá i současně platné sedmé vydání TNM klasifikace zhoubných novotvarů (21).

• TNM klasifikace mikrometastáz a izolovaných nádorových buněk

Za mikrometastázu je dle platné TNM klasifikace považováno nádorové ložisko v lymfatické uzlině do 0,2 cm. V rámci klasifikace lze použít označení např. N1(mi), nebo N2a(mi). Izolované nádorové buňky (isolated tumour cells – ITC) jsou jednotlivé buňky nebo shluky buněk velikosti nejvýše do 0,2 mm. Jako doplňující kritérium byl určen počet buněk, který by v jednom histologickém řezu neměl přesáhnout 200 buněk. Pro ITC platí, že nevykazují známky metastatické aktivity (proliferaci či reakci stromatu, nebo penetraci do stěny cévních a mízních splavů). Případy s ITC v mízních uzlinách by měly být klasifikovány jako N0, přičemž pozitivitu ITC lze uvést v závorce, tedy pN0(i+). Kategorie ITC může být dále rozdělena na ITC detekovatelné světelnou mikroskopií, ITC prokázané imunohistochemicky (při negativní světelné mikroskopii) a ITC zjištěné molekulárními metodami (2, 9).

MOŽNOSTI DIAGNOSTIKY METASTÁZ V KRČNÍCH UZLINÁCH

• Standardní techniky detekce

V současnosti neexistuje zobrazovací technika, která by se blížila 100% senzitivitě či specificitě při diagnostice metastáz v krčních uzlinách. Klinické vyšetření podhodnocuje nález klinicky pozitivních uzlin a dosahuje falešně negativních výsledků ve 20-30 % (1). Z jednotlivých metod bývá nejčastěji využívána počítačová tomografie (CT) s kontrastem, magnetická rezonance (MR), sonografie v kombinaci s aspirační cytologií a nověji také pozitronová emisní tomografie (PET), často v podobě fůze s morfologickou zobrazovací metodou (CT či MR). Zlatým standardem pro odhalení metastáz v krčních uzlinách zůstává histopatologické vyšetření lymfatických uzlin, odstraněných při exstirpaci uzliny nebo blokové krční disekci. V současnosti však není určeno, kolik histologických řezů musí být vyšetřeno v rámci každé lymfatické uzliny ke stanovení pTNM klasifikace. Pokud je lymfatická uzlina vyšetřena pouze několika řezy vedoucími centrální částí uzliny, mikrometastázy lokalizované mimo tuto centrální osu (typicky subkapsulárně) nejsou diagnostikovány (6). Mikrometastázy proto nebývají odhaleny nejen moderními diagnostickými zobrazovacími metodami, ale ani rutinním histopatologickým vyšetřením (1, 4). Řada autorů uvádí významné zvýšení záchytu mikrometastáz při použití sériových řezů, jejichž použití bývá kombinováno s imunohistochemickým vyšetřením.

• Imunohistochemické vyšetření

Zvýšení detekce nádorových buněk přináší imunohistochemické vyšetření, které prokazuje mikrometastázy přibližně u 20 % pacientů s negativním výsledkem při běžném histopatologickém vyšetření (4). Ideální nádorový marker je exprimován nádorový buňkami, ne však normální tkání lymfatické uzliny. Příkladem je prostatický specifický antigen (PSA) u karcinomu prostaty nebo tyrozináza, melan A a S-100 protein u maligního melanomu. Pro dlaždicobuněčný karcinom polykacích a dýchacích cest však doposud neexistuje specifický typ nádorového markeru. Proto jsou nejčastěji k průkazu nádorových struktur využívány protilátky proti epiteliálním antigenům, nejčastěji proti směsi cytokeratinů (CK), např. protilátka AE1/AE. CK jsou exprimovány dlaždicobuněčným epitelem a tvoří část buněčných filament, které přispívají k tvaru a vnitřní organizaci buňky. Rozeznáváme CK typu I (A), které mají nízkou molekulovou hmotnost (např. CK 10 a CK 12-19) a CK typu II (B) s vysokou molekulovou hmotností (např. CK 1-8). Zatímco dobře diferencované epiteliální nádory jsou typické vyšší produkcí CK typu I, u nízce diferencovaných nádorů dochází ke snížení produkce CK typu I (1). Jelikož CK nejsou za normálních okolností buňkami lymfatické uzliny výrazněji exprimovány, jejich pozitivní průkaz je při odpovídajícím mikroskopickém nálezu považován za známku metastázy karcinomu (19). Výsledek imunohistochemického vyšetření je však nutné vždy s mikroskopickým nálezem korelovat – v lymfatických uzlinách se totiž relativně často mohou nacházet různé typy tzv. inkluzí, z nichž některé rovněž exprimují CK. Tyto inkluze jsou zcela benigní, svou malou velikostí, subkapsulární lokalizací a neinvazivním chováním však mohou mikrometastázy (např. karcinomu či maligního melanomu) do značné míry napodobovat.

Prioritní výzkum záchytu mikrometastáz imunohistochemickými metodami byl prováděn především u karcinomu prsu. Jedním z prvních autorů, který upozornil na vysoké procento mikrometastáz nedetekovatelných standardním histologickým vyšetřením, byl Dowlatshahi (3). Při vyšetření sentinelových uzlin 52 pacientek s karcinomem prsu standardním histologickým vyšetřením s použitím řezů po 2 mm byly metastázy diagnostikovány u šesti nemocných (12 %). Sériovým prokrájením lymfatických uzlin s použitím řezů po 0,25 mm a následným imunohistochemickým vyšetřením proti CK se záchyt mikrometastáz zvýšil na 30 pacientů (58 %). V posledních letech se celá řada autorů věnuje také imunohistochemickému průkazu krčních mikrometastáz. Záchyt mikrometastáz u klinicky N0 nemocných se pohybuje ve velice širokém rozmezí od 2 do 58 % (7, 11, 14, 15, 22, 26, 28), což svědčí pro skutečnost, že metodika vyšetření je často nejednotná a procento zachycených mikrometastáz je závislé také na zkušenostech vyšetřujícího histopatologa. V naší literatuře referovali o možnostech záchytu mikrometastáz u dlaždicobuněčného karcinomu hlavy a krku Štefanička a kol. (23).

Technika sériového prokrájení lymfatické uzliny s následným histologickým a imunohistochemickým vyšetřením je dnes běžně využívána při vyšetření sentinelové lymfatické uzliny u karcinomu prsu a maligního melanomu. Tento koncept, bohužel, nelze u většiny karcinomů ORL oblasti použít, jelikož tyto nádory mají tendenci vytvářet tzv. „skip“ metastázy (5). To znamená, že neexistuje jedna sentinelová uzlina predilekčně postižená metastatickým procesem, ale že metastázy mohou být tvořeny primárně ve vzdálenější části řetězce lymfatických uzlin. Sériové prokrájení všech lymfatických uzlin odstraněných při krční disekci s použitím imunohistochemického vyšetření je také velice pracné a časově a finančně náročné. Tento postup je tedy prozatím používán pouze v rámci výzkumných projektů.

• Molekulárně genetické metody 

 Vyšší citlivost než imunohistochemické vyšetření má molekulární vyšetření. Jedná se o moderní a vysoce citlivou metodu pro diagnostiku mikrometastáz. Metoda využívá k detekci specifických antigenů (např. CK nebo SCC - squamous cell carcinoma antigen) genové metody, které jsou založeny na PCR (polymerase chain reaction) nebo na RT-PCR (reverse-transcriptase polymerase chain reaction) (9, 10, 16, 20).

Molekulární analýza je až 500krát citlivější než standardní histopatologické techniky a je schopna identifikovat jednu nádorovou buňku mezi 10 000 nenádorových buněk. Naproti tomu světelná mikroskopie identifikuje jednu nádorovou buňku mezi 20 nádorovými buňkami. Genetická klasifikace lymfatických uzlin je považovaná za přesnější než klasifikace patologická. Problémem však zůstávají časová a finanční náročnost, a tedy problematické použití metody v klinické praxi. Slibnou se v tomto směru jeví tzv. OSNA (one-step nucleic acid amplification), která kvantitativně měří expresi mRNA (messenger ribonukleová kyselina). Jelikož výsledek vyšetření bývá k dispozici přibližně za 30 minut, lze metodu použít dokonce i k detekci mikrometastáz v rámci peroperačního vyšetření (25).

KLINICKÝ VÝZNAM PŘÍTOMNOSTI MIKROMETASTÁZ V KRČNÍCH UZLINÁCH

Není pochyb o tom, že je nutné rozlišovat nález ITC od mikrometastáz. Pouhá přítomnost nádorových buněk totiž neznamená, že musí nutně dojít k jejich implantaci a následnému nádorovému růstu. Většina nádorových buněk, dostávajících se do lymfatického řečiště apoptoticky hyne, nebo je odstraněna imunitními mechanismy. Malé shluky nádorových buněk mohou přežít díky výživě difuzí z okolních tkání. Pro další pokračování nádorového růstu je již nutný vznik neoanginogeneze, nicméně i v případě jejího vzniku závisí další osud nádorových buněk na interakci mezi nádorem a tkáněmi hostitele (6).

Názory na roli imunitních funkcí v rámci obrany proti nádorovým chorobám se v průběhu posledních desetiletí významně měnily. Dle současného konceptu je imunitní systém schopen maligní buňky buď eliminovat, nebo naopak díky trvalému selekčnímu tlaku paradoxně indukovat vznik odolnějšího nádorového fenotypu. Na eliminaci nádorů se podílejí buňky přirozené imunity (dendritické buňky), specifické imunity (cytotoxické T lymfocyty, pomocné T lymfocyty), složky nacházející se na hranici mezi přirozenou a specifickou imunitou (NK buňky a NK-T buňky) i některé humorální faktory (interferony, produkty cytotoxických T lymfocytů a NK buněk - perforiny a granzymy) (17).

Dle současné klasifikace rozeznáváme minimálně tři rozdílné typy buněčné smrti: apoptózu (typ 1), autofagii (typ 2) a nekrózu (typ 3) (24). Apoptóza je primárně definována morfologickými změnami buněk, které jsou následně likvidovány fagocytózou. Apoptózu může navodit celá řada mechanismů, např. hypoxie, nedostatek výživy, ale také radioterapie a chemoterapie. Proto byla apoptóza v minulosti považována za imunologicky němou formu buněčné smrti. Současné výzkumy však ukazují, že imunitní systém sehrává významnou roli také v mechanismech buněčné smrti. V této souvislosti se stále častěji hovoří o tzv. „imunogenní smrti buňky“, nebo o imunogenní apoptóze (8, 12, 13). Koncept zahrnuje vznik imunogenních signálů v důsledku změn membránových charakteristik buňky a současně uvolnění humorálních působků. Tyto signály vedou k aktivaci dendritických buněk s následným rozvojem imunitní odpovědi.

Jedním z typických znaků nádorových buněk je odolnost vůči imunitnímu systému i apoptóze (nevnímavost k proapoptotickým stimulům). Usnadnění rozpoznání nádorových buněk imunitním systémem a léčebné navození imunogenní smrti buňky (například chemoterapií či radioterapií) při současné podpoře imunitních mechanismů se proto jeví jako logická možnost zvýšení účinnosti komplexní protinádorové léčby.

Zatímco význam přítomnosti ITC v lymfatické uzlině a jejich vlivu na prognózu nádorového onemocnění zůstává nejasný, ukazuje se, že přítomnost mikrometastáz je klinicky významná (4, 18). Nieuwenhuis (16) prokázal, že přežití pN0 pacientů s nálezem jedné či více mikrometastáz (prokázaných molekulární analýzou) bylo signifikantně horší než u nemocných s molekulárně negativními uzlinami. K obdobným závěrům dochází také Xu a Yamazaki (26, 27). Přítomnost nerozpoznaných a neodstraněných mikrometastáz může také vysvětlovat regionální recidivy nádorů u pacientů původně klasifikovaných jako N0 nebo u pacientů N+ po předchozí selektivní krční disekci. Vyšší riziko přítomnosti okultních metastáz či mikrometastáz platí zejména pro karcinomy polykacích cest a pro supraglotický karcinom hrtanu. Jelikož lze předpokládat, že neodstraněné mikrometastázy mohou dále růst a stát se metastázami klinicky zřejmými, nadále platí indikace k elektivní krční disekci u nádorů s vyšší pravděpodobností tvorby mikrometastáz. 

ZÁVĚRY

• Dlaždicobuněčný karcinom hlavy a krku má tendenci k tvorbě mikrometastáz, jejichž frekvence je podstatně vyšší než odpovídá frekvenci klinicky zjistitelných makrometastáz.
• Mikrometastázy nejsou detekovatelné běžnými klinickými diagnostickými metodami a nemusí být zjištěny ani standardním histologickým vyšetřením. K jejich průkazu jsou nejčastěji využívány imunohistochemické a molekulárně genetické metody.
• Je nutné důsledně rozlišovat mikrometastázy a ITC. Zatímco prognostický vliv průkazu ITC v lymfatické uzlině zůstává nejasný, nález mikrometastáz lze považovat za klinicky významný.
• Jelikož lze v případě mikrometastáz očekávat další růst nádorové tkáně, je vhodné doporučit  provedení elektivní krční disekce u nádorů s vyšší tendencí k tvorbě mikrometastáz.

Poděkování

Podpořeno projektem (Ministerstva zdravotnictví ČR) koncepčního rozvoje výzkumné organizace 00179906 (institucionální výzkum 8154), programem PRVOUK P37/11 a projektem LM2010004.

Adresa ke korespondenci:

MUDr. Petr Čelakovský, Ph.D.

Klinika ORL a chirurgie hlavy a krku LF UK a FN

Sokolská 581

500 05  Hradec Králové

e-mail: petr.celakovsky@fnhk.cz