Beta defensiny 2 a 3 ve sliznici nosních polypů u nemocných s chronickou rinosinusitidou s nosními polypy a s kultivačním nálezem – Staphylococcus aureus na nosní sliznici

Overview

Chronická rinosinusitida s nosními polypy je zánětlivé onemocnění, v jehož etiopatogenezi se může uplatňovat bakteriální infekce. Lidské beta defensiny ( human beta defensins, HBD) jsou antimikrobiální peptidy, které představují důležitou složku vrozené slizniční imunity.

Cíl práce:
Cílem bylo zjistit, zda je přítomnost HBD 2 a 3 prokazatelná ve vyšším množství v nosních polypech při porovnání se zdravou nosní sliznicí.

Metoda:
Před odběrem nosních polypů bylo provedeno kultivační vyšetření sekretu z nosní dutiny. Vzorky zdravé nosní sliznice (n = 11) a nosní polypy (n = 9) byly pro světelně mikroskopické zpracování fixovány ve 4% formaldehydu pro zpracování technikou zalití do parafínu, část materiálu byla zamražena v tekutém dusíku při teplotě -80°C.

HBD 2 a 3 byly zjišťovány na parafinových i kryostatových řezech imunohistochemickými metodami pomocí třístupňové imunoperoxidázové techniky.

Výsledky:
Nejčastějším vykultivovaným patogenem u nemocných s nosními polypy byl Staphylococcus aureus. V klinicky zdravé nosní sliznici byla přítomnost HBD-2 zjištěna v jednotlivých buňkách žlázových vývodů a v řasinkových buňkách. V polypózním materiálu byla přítomnost HBD-2 prokázána ve větším množství než u klinicky zdravé nosní sliznice. HBD-2-byl prokazován v řasinkových buňkách a v cytoplazmě buněk žlázových vývodů. HBD-3 byl nalezen v řasinkových buňkách povrchového epitelu i v buňkách žlázových vývodů v polypech. Reakční produkt průkazu HBD-3 se vyskytoval v extremně velkém množství v cytoplazmě buněk, jak povrchového epitelu, tak i v buňkách žlázových vývodů u vzorků z polypů s prokázanou přítomností Staphylococcus aureus.

Závěr:
Zjistili jsme vyšší výskyt defensinů HBD 2 i 3 ve tkáni nosních polypů v porovnání se zdravou nosní sliznicí. HBD 3 byl prokázán v extremně velkém množství u vzorků z polypů s prokázanou přítomností Staphylococcus aureus.

Klíčová slova:
beta defensiny, nosní polypy, Staphylococcus aureus.

ÚVOD

Chronická rinosinusitida je zánětlivé onemocnění nosu a vedlejších nosních dutin. Podskupinu chronické rinosinusitidy představují nemocní s nosními polypy. Etiopatogeneze tohoto onemocnění není dosud zcela objasněna, lze však s vysokou pravděpodobností očekávat multifaktoriální charakter tohoto onemocnění na straně jedné a na straně druhé se může lišit u jednotlivých podskupin onemocnění (4).

Bakteriální infekce je považována za jeden z možným etiologických faktorů. U nemocných s chronickou rinosinusitidou a nosními polypy je častým nálezem Staphylococcus aureus. Zdravá sliznice horních cest dýchacích má řadu velmi účinných mechanismů, kterými se proti bakteriím brání. Teoreticky může být porucha těchto mechanismů příčinou bakteriálního osídlení a může se podílet i na patogenezi chronického zánětu a tvorbě nosních polypů.

Lidské beta defensiny ( human beta defensins, HBD) jsou antimikrobiální peptidy, které představují důležitou složkou vrozené slizniční imunity. Mají jak přímé antibiotické účinky, tak účinky imunomodulační. Beta defensiny se dělí do několika skupiny, beta defensin 1 se na sliznici respiračního traktu vyskytuje konstitučně, defensiny 2 a 3 jsou produkovány jako reakce na infekci.

Cílem naší práce bylo zjistit, zda u nemocných s nosními polypy a nálezem Staphylococcus aureus je produkce defensinů v porovnání se zdravými jedinci zvýšená nebo snížená.

MATERIÁL A METODY

Vzorky klinicky zdravé nosní sliznice (n = 1) byly získány ze zadní části dolní skořepy  od pacientů, podstupujících operaci z důvodu deviace nosní přepážky. Materiál z nosních polypů byl získáván v průběhu endoskopických operací od pacientů s klinicky diagnostikovanými nosními polypy (n = 9). U těchto pacientů bylo před výkonem provedeno kultivační vyšetření z nosní dutiny. Sekret byl odebrán endoskopicky ze středního nosního průchodu.

Získaný materiál pro světelně mikroskopické zpracování byl fixován ve 4% formaldehydu (připraveném z paraformaldehydu-PFA v PBS-fosfátový pufr pH 7,4 s osmotickým nastavením dalšími ionty) pro zpracování technikou zalití do parafínu, část materiálu  byla zamražena v tekutém dusíku a po celou dobu před krájením v kryostatu uchovávána v hlubokomrazícím boxu při teplotě  -80 °C.

HBD 2 a 3 byly zjišťovány na parafinových i kryostatových řezech  imunohistochemickými metodami pomocí třístupňové imunoperoxidázové techniky.

Kryostatové řezy pro detekci defensinů byly fixovány ve 4% PFA v PBS. Pro blokování nespecifické vazby bylo použito 2% fetální hovězí sérum (Biosera,UK) po dobu 30 minut. V dalším kroku byly řezy inkubovány s primární protilátkou [Anti-Rabbit-HBD-2 (Peptide Institute, Inc., Japan) 1: 200, Anti-Rabbit-HBD-3 (Orbigen, USA) 1:100] po dobu 60 min. při pokojové teplotě. Po opláchnutí v PBS byly řezy inkubovány s biotinylovanou sekundární protilátkou Goat-Anti-Rabbit IgG v PBS (Sigma-Aldrich, USA) v poměru 1:200 nebo Goat-Anti-Mouse IgG v PBS (Sigma-Aldrich, USA) v poměru 1:400 po dobu 30 min. při pokojové teplotě. Následovalo  3x vyprání v PBS a poté inkubace s Vectastain ABC Elite kit peroxidáze (VECTOR lab., USA) ředěné v PBS pro ABC (1:50) po dobu 30 minut. Po dalším opláchnutí v PBS (po dobu 5 min.) byly vzorky vystaveny působení detekčního roztoku (Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substráte solution - DAKO Cytomation, Denmark) do objevení hnědého zbarvení (za vizuální kontroly mikroskopem).

Jádra byla dobarvována kamencovým Harrisovým hematoxylinem po dobu 5 sekund. V případě parafínových řezů bylo po deparafinaci (2 lázně xylenu, 2 lázně 96% etanolu) prováděno odhalení antigenních determinant v TRIS pufru (pH 9,5) v mikrovlnné troubě (1 minuta 560 W a 5 minut 240 W). Aktivita endogenní peroxidázy byla blokována 70% metanolem a 1% peroxidem vodíku po dobu 10 min. při pokojové teplotě. Vlastní imunohistochemická detekce byla prováděna stejným postupem jako u kryostatových řezů.

VÝSLEDKY

Při bakteriologickém vyšetření sekretu při nosní polypóze byl prokázán Staphylococcus aureus u 10 nemocných, Staphylococcus koaguláza negativní u 16 nemocných, negativní výtěr byl u 18, jiný kultivační nález byl u 5 nemocných.

Studie byla zaměřena na detekci dvou podskupin lidského beta defensinu (HBD), a to HBD-2 a HBD-3. I když oba defensiny (HBD-2 a HBD-3) byly prokázány jak v klinicky zdravé tak i v polypózní nosní sliznici, lišily se v intenzitě nakupení reakčního produktu.

V klinicky zdravé nosní sliznici byla přítomnost HBD-2 zjištěna v jednotlivých buňkách žlázových vývodů (obr. 1). Také v povrchovém víceřadém cylindrickém epitelu byl tento defensin (HBD-2) detekován v řasinkových buňkách.

Ve zdravé nosní sliznici byl HBD 3 prokázán v cytoplazmě buněk vývodů žláz (obr. 2).

V polypózním materiálu byla přítomnost reakčního produktu výsledného imunohistochemického průkazu HBD-2 zachycena ve větším množství než u klinicky zdravé nosní sliznice. HBD-2-byl prokazován v bazální části řasinkových buněk povrchového víceřadého cylindrického epitelu (obr. 3) podobně jako v cytoplazmě buněk žlázových vývodů. Výsledky průkazu HBD-2 nebyly kvalitativně odlišné ve vzorcích s pozitivním průkazem Staphylococcus aureus i ve vzorcích bez jeho průkazu.

HBD-3 byl nalezen v bazálních oddílech cytoplazmy řasinkových buněk povrchového epitelu i v buňkách žlázových vývodů v polypech, kdy Staphylococcus aureus nebyl prokázán. Zajímavým nálezem bylo zjištění, že reakční produkt průkazu HBD-3 se vyskytuje v extremně velkém množství  v cytoplazmě buněk, jak povrchového epitelu (obr. 4), tak i v buňkách žlázových vývodů  u vzorků z polypů s prokázanou přítomností Staphylococcus aureus.

DISKUSE

Skupina nemocných s chronickou rinosinusitidou s nosními polypy a kultivačním nálezem Staphylococcus aureus, je jasně definovaná, ale i tak je zcela jistě nehomogenní. Pro další přesnější klasifikaci bychom mohli rozdělovat nemocné dále například podle anamnestického údaje o intoleranci kyseliny acetylosalicylové, bronchiálním astmatu, alergii, cystické fibróze, kortikoterapii nebo podle histologického nálezu tkáňové eozinofilie.

Staphylococcus aureus je uváděn jako nejčastější patogen u nemocných s chronickou rinosinusitidou s nosními polypy (9). Tomuto údaji odpovídá také nález v našem souboru nemocných, kde byl sice kultivačně četnější Staphylococcus koaguláza negativní, který ale na nosní sliznici není považován za patogenní bakterii. HBD 2 působí na bakterii Staphylococcus aureus bakteriostaticky, HBD 3 baktericidně (13).

Sledovali jsem beta defensiny, které představují klíčovou složku přirozené slizniční imunity. Defensiny patří do skupiny antimikrobiálních peptidů. Na povrch respirační sliznice se dostávají jako součást serózní sekrece, která má původ ve žlázách a buňkách. V serózní složce sekretu pokrývajícího respirační sliznici jsou i další antimikrobiální peptidy, a to lysozym a laktoferin (3). Tyto látky se do sekretu dostávají z epiteliálních buněk, serózních buněk submukózních žlaz a z krve. Tomu v naší práci odpovídá i průkaz defensinů, a to v bazální části epitelových buněk a ve vývodech submukózních žláz respirační sliznice horních dýchacích cest. Hodnotili jsme beta defensin 2 a 3, které jsou syntetizovány jako reakce na infekci (11, 13, 14, 15).

HBD 2 jsme prokázali ve zdravé sliznici, ale jen v jednotlivých buňkách. Tento nález souhlasí s výsledky prací jiných autorů (2, 6) a je v rozporu s jednou prací, kde HBD 2 ve zdravé sliznici nebyly zjištěny (8). HBD 2 jsme našli výrazně v nosních polypech v porovnání se zdravou sliznicí, což odpovídá řadě publikovaných nálezů (1, 6, 8). Nejvýraznější zvýšení HBD 2 bylo potvrzeno u polypů nemocných s cystickou fibrózou (2).

HBD 3 v nosní sliznici zatím nebyly příliš zkoumány. Je publikována jedna práce, kde HBD 3 nebyly prokázány ani ve zdravé sliznici ani v polypech (2). Prokázali jsme minimální přítomnost HBD 3 ve zdravé sliznici a nápadně vyšší přítomnost ve tkáni nosních polypů.

Je možno předpokládat, že defensiny ovlivňují náchylnost k bakteriální infekci a mohou přispívat k zvýšené produkci cytokinů a chemokinů (10). V porovnání se zdravou nosní sliznicí jsme prokázali vyšší výskyt defensinů u nemocných se zánětlivým onemocněním nosu, tedy nosní polypózou a nosní polypózou provázenou bakteriální infekcí. V současné době víme, že defensiny se uplatňují v patogenezi dvou jiných zánětlivých onemocněních sliznice, a to Crohnovy choroby (16) a cystické fibrózy (5).

Do budoucna bude zajímavé a přínosné sledovat výskyt defensinů ve vztahu k receptorům, u kterých se předpokládá jejich spolupráce s defensiny a jejich účast v patogenezi chronického zánětu u chronické rinosinusitidy s nosní polypózou. Mezi tyto receptory patří především toll like receptory (1, 12).

ZÁVĚR

Zjistili jsme vyšší výskyt defensinů HBD 2 i 3 ve tkáni nosních polypů v porovnání se zdravou nosní sliznicí. Velmi nápadná byla přítomnost HBD 3 v nosních polypech s kultivačním nálezem – Staphylococcus aureus.

Práce byla podporována grantem NR8440-3/2005.

Došlo 31. 12. 2007 Doc. MUDr. Zdeňka Kuchynková, CSc.

Klinika ORL a chirurgie hlavy a krku 1. LF UK a FN Motol

V Úvalu 84

150 06 Praha 5–Motol

e-mail: Z.Kuchynkova@gmail.com