Příprava ²²³Ra a ^99mTc značených hydroxyapatitů a jejich in vitro stabilita

Úvod:
Cílené radionuklidové terapii alfa zářiči je věnována stále větší pozornost. Biokompatibilní nanohydroxyapatity (nHAp) značené ²²³Ra a ^99mTc jsou vhodnými kandidáty pro využití v terapii a diagnostice kostních metastáz. Samotný hydroxyapatit i oba nuklidy jsou schváleny FDA a využívají se v řadě aplikací.

Materiál a metoda:
Spolusrážením roztoků 1,2 M Ca(NO₃)₂ . 2H₂O a 0,8 M (NH₄)₂HPO₄ při pH 10–11 za laboratorní teploty byly připraveny nHAp. Jako zdroj ²²³Ra byl použit generátor ²²⁷Ac/²²⁷Th/²²³Ra, připravený na Katedře jaderné chemie, který byl eluován 0,7 M HNO₃ a methanolem (2 : 8). Jako zdroj ^99mTc byl použit generátor DRYTEC^TM (GE Healthcare Ltd.) eluovaný 0,9% roztokem NaCl. Radionuklidová čistota eluátů byla stanovena pomocí gama spektrometrie s vysokým rozlišením (v případě eluátu ²²³Ra i pomocí alfa spektrometrie). Pro značení byly zvoleny dvě strategie a to jednak povrchová adsorpce radionuklidu a dále spolusrážení in situ. Následně byla provedena kontrola stability ve fyziologickém roztoku po dobu 5 poločasů.

Výsledky:
Při povrchovém značení byly nHAp značeny s výtěžkem 80–95 %. Ve druhém případě byly získány objemově značené nHAp ve výtěžku 90–97 %.

Závěr:
Výtěžky objemového značení [²²³Ra]nHAp byly v porovnání s povrchovým značením nepatrně lepší. V případě značení [^99mTc]nHAp jsou výsledky povrchového i objemového značení srovnatelné. Uvolněná aktivita se pohybovala pod 8 %.

Klíčová slova:
^99mTc, ²²³Ra, nanomateriály, hydroxyapatit, terapie a diagnostika, kostní metastázy

Úvod

Hydroxyapatity reprezentují skupinu minerálních látek nacházejících se v živých soustavách jako složky zubů a kostí. Díky své biokompatibilitě a afinitě ke kostní tkáni jsou nanočástice hydroxyapatitu (nHAp) a jejich kompozity používány v mnoha biomedicínských aplikacích ve formě granulí či bloků např. jako kostní implantáty, přičemž jejich používání v medicíně bylo schváleno Úřadem pro kontrolu potravin a léčiv (Food and Drug Administration, FDA). ¹ Dále jsou studovány v nanomedicíně jako pH-responzivní nosiče pro cytostatika (např. doxorubicin) a monoklonální protilátky (např. DO-24 mAb, lidské IgCs). ^{2, 3, 4}

V poslední době je nanohydroxyapatitům věnována pozornost hlavně v nukleární medicíně, kde jsou studovány jako potenciální nosiče jak pro diagnostiku s využitím izotopů ¹⁸F a ⁶⁸Ga ⁵, ale také v terapii ve spojení s ¹²⁵I, ¹⁵³Sm a ²²³Ra. ^{6, 7, 8, 9}  Zvláště pro cílenou alfa terapii kostních metastáz s ²²³Ra se nanohydroxyapatity jeví jako vhodnější nosiče, především z důvodů biologické kompatibility s cílovou tkání, dobré radiační stability a schopnosti termalizace odražených atomů při přeměně mateřského radionuklidu ¹⁰ ve srovnání se studovanými polymerními systémy jako např. polymerozomy. ¹¹ Využití modifikovaných hydroxyapatitů je demonstrováno na příkladu PET radionuklidů ¹⁸F a ⁶⁸Ga, které byly použity při značení jak v krystalové mřížce hydroxyapatitu s využitím [¹⁸F]NaF, tak u povrchově funkcionalizovaného nHAp s [⁶⁸Ga]NO2AP^BP. ⁵

Cílem této práce je příprava a studium in vitro stability [²²³Ra]nHAp a [^99mTc]nHAp ve fyziologickém prostředí. Pro přípravu značených nHAp byly zvoleny dva postupy, jednak povrchové značení již připravených nHAp, které je založeno na adsorpci daného radionuklidu na povrch nanomateriálů, a dále značení nosičů spolusrážením s ionty radionuklidů v roztoku. ^{9, 10}

Kombinace ²²³Ra a ^99mTc byla vybrána cíleně. ²²³Ra bylo schváleno FDA a zařazeno do Evropského lékopisu (registrováno i v ČR) pro paliativní léčbu kostních metastáz. ¹² Nanočástice hydroxyapatitu jsou v této fázi studovány jako potenciální nosiče ²²³Ra, které by v kombinaci se SPECT radionuklidem ^99mTc mohli přinést například informace o postupu terapie. Nanohydroxyapatity by tak naplnily theranostický koncept nosiče.

Materiál a metoda

Nanočástice hydroxyapatitu byly připraveny srážením 1,2 M roztoku Ca(NO₃)₂ . 2H₂O a 0,8 M roztoku (NH₄)₂HPO₄ za laboratorní teploty, přičemž před přídavkem vápenaté soli bylo pH roztoku upraveno roztokem NH₄OH na 10–11. Suspenze byla míchána po dobu 1 hodiny a následně byla centrifugována při 3 000 otáčkách za minutu (rpm) po dobu 10 min. Použité chemikálie byly v kvalitě p. a. (Lachner nebo VWR International s. r. o.).

Zpracování bylo provedeno opakovaným promýváním ultračistou vodou získanou ze stanice Millipore Direct Q3 (Merck), následně byly připravené nHAp sušeny pod vakuem na vakuové lince s inertní větví, připojenou přes nízkoteplotní chladič chlazený kapalným dusíkem anebo ponorným chladičem HUBER TC50 k olejové vývěvě VR 04 (Lavat s. r. o.). Struktura připravených nHAp byla potvrzena pomocí FT-IR spektrometrie (Fourier Transform Infrared Spectrometry) na spektrometru iS50 (Nicolet) ve střední infračervené oblasti s rozlišením 2 cm^-1 metodou difuzní reflektance. Prášková difrakce XRPD (X-ray Powder Diffraction) byla měřena na přístroji Rigaku MiniFlex 600s měděnou katodou (Cu-Kα1,2) a NaI(Tl) scintilačním detektorem. Difraktogram byl zaznamenáván kontinuálně od 10° do 80° 2θ s rychlostí snímání 5° 2θ/min.

Příprava [²²³Ra]nHAP

Zdrojem ²²³Ra byl generátor ²²⁷Ac/²²⁷Th/²²³Ra, který byl připraven sorpcí roztoku ²²⁷Ac (směs ²²⁷Ac v rovnováze se svými dceřinými produkty, (Amersham, UK)) na kolonku iontoměniče Dowex-1 (Sigma-Aldrich). (Obr. 1a) Eluce ²²³Ra byla prováděna 0,7 M HNO₃ a CH₃OH (2 : 8). ¹³ Ze získaného eluátu byl nejprve na vakuové odparce odpařen CH₃OH, následně byl ²²³Ra(NO₃)₂ rozpuštěn v 300 μl destilované vody a pH bylo upraveno pomocí NH₄OH (aq, 50 μl) na pH 11. Radionuklidová čistota byla stanovena pomocí gama spektrometrie s vysokým rozlišením a alfa spektrometrie.

Značení [²²³Ra]nHAp spolusrážením probíhalo následovně: ²²³Ra(NO₃)₂ (300 μl, 18 kBq) byl přidán k roztoku 0,8 M (NH₄)₂HPO₄ (40 μl, 32 μmol), poté bylo pH upraveno pomocí NH₄OH (aq, 2 kapky) a za stálého míchání byl přidáván 1,2 M Ca(NO₃)₂ (40 μl, 48 μmol).

Značení [²²³Ra]nHAp adsorpcí na povrchu bylo prováděno následovně: k navážce nHAp (5 mg) byl přidán fyziologický roztok (40 μl) a směs byla dispergována pomocí vibrační míchačky a následně byl přidán roztok ²²³Ra(NO₃)₂ (300 μl, 18 kBq).

Vzorky byly míchány 1 hodinu za laboratorní teploty a následně centrifugovány při 3000 rpm po dobu 10 min. Zpracování proběhlo následně: supernatant byl odebrán a vzorky byly 3x promyty fyziologickým roztokem. Roztoky nad značenými vzorky byly vždy odebrány do samostatných zkumavek a společně s [²²³Ra]nHAp byly měřeny na NaI(Tl) detektoru (CRC-55tW CAPINTEC, USA) a gama spektrometru (Ortec, USA). U vzorků byl následně stanoven radiochemický výtěžek (Tab. 1) a procento uvolněné aktivity po 24 hodinách a v daných poločasech ve fyziologickém roztoku. (Obr. 2)

Příprava [^99mTc]nHAp

^99mTc bylo získáno z komerčně dostupného generátoru DRYTEC^TM (GE Healthcare Ltd.) elucí 0,9% roztokem NaCl. (Obr. 1b) Eluovaná aktivita se první den pohybovala okolo 0,2 GBq/ml. Radionuklidová čistota byla kontrolována pomocí gama spektrometrie s vysokým rozlišením.

Při značení [^99mTc]nHAp spolusrážením bylo nutné nejprve Na^99mTcO₄ (1 ml, 200 MBq) zredukovat mícháním s roztokem chloridu cínatého po dobu 30 minut. Následně byl přidán 0,8 M (NH₄)₂HPO₄ (40 μl, 32 μmol), poté bylo pH upraveno pomocí 1 M NaOH (aq, 2 kapky) a za míchání byl přidáván 1,2 M Ca(NO₃)₂ (40 μl, 48 μmol).

Při přípravě povrchově značených [^99mTc]nHAp byl k navážkám nHAp (5 mg) přidán vodný roztok chloridu cínatého (500 μl) a vzorky byly dispergovány pomocí vibrační míchačky. Následně byl přidán roztok Na^99mTcO₄ (1 ml, 150 MBq).

Vzorky byly míchány 1 hodinu za laboratorní teploty a poté centrifugovány při 3000 rpm po dobu 10 min. Následně byly zpracovány stejným způsobem jako v případě značení ²²³Ra. Odebraný supernatant a [^99mTc]nHAp byly měřeny na ionizační komoře (CRC-55tW CAPINTEC, USA). Byl stanoven radiochemický výtěžek (Tab. 2) a procento uvolněné aktivity v poločasech ve fyziologickém roztoku. (Obr. 3)

Sledování stability ve fyziologickém roztoku

Množství uvolněné aktivity ze značených [²²³Ra]nHAp a [^99mTc]nHAp (povrchově i objemově) ve fyziologickém roztoku v podmínkách in vitro bylo sledováno u vybraných vzorků v čase. (Obr. 2 a Obr. 3) Ke vzorkům byl přidán fyziologický roztok (300 μl) a byly dispergovány. Po uplynutí daného časového intervalu (²²³Ra – 11,3 d, ^99mTc – 6 h) byly centrifugovány při 3000 rpm (10 min) a celý postup byl opakován. Byla změřena aktivita supernatantu a značeného nHAp a stanoveno procento uvolněné aktivity z nanočástic do fyziologického roztoku.

Výsledky

Radionuklidová čistota stanovená alfa a gama spektrometrií byla vyšší než 95 %. Pro přípravy značených nHAp byly zvoleny dva postupy: povrchová sorpce a spolusrážení in situ. U druhého popisovaného postupu by měla být výrazným pozitivem inkorporace radionuklidu přímo do struktury hydroxyapatitu. Ionty ²²³Ra²⁺ tedy přímo substituují atomy Ca²⁺ v krystalové mřížce. U hydroxyapatitů značených ^99mTc (i obecně dalších radionuklidů ve valenčním stavu jiném než 2+) se lze domnívat, že ^99mTc⁴⁺ jsou po redukci zachyceny v intersticiálních polohách krystalové mříže a tudíž dochází  k jejich významné retenci.

Hydroxyapatit byl připraven s výtěžkem 98 % a jeho struktura byla potvrzena pomocí FT-IR a XRPD. V infračerveném spektru hydroxyapatitu jsou viditelné následující pásy: 3380, 1638, 1009, 598 a 558 cm^-1 (Obr. 4), což je v souladu s literaturou. ¹⁴ Při porovnání naměřeného difraktogramu nHAp a difraktogramu z databáze bylo potvrzeno, že se jedná o nHAp s krystalickou hexagonální strukturou (Obr. 5), přičemž velikost částeček byla stanovena na 15 nm.

Celkem bylo připraveno 6 vzorků [²²³Ra]nHAp značených na povrchu (P) a 6 vzorků [²²³Ra]nHAp značených spolusrážením. (V) (Tab. 1) Stejné množství vzorků bylo připraveno i s ^99mTc. (Tab. 2) Výtěžek značení (Y) byl vypočítán dle vztahu (1), přičemž v případě značení s ^99mTc bylo nutné vstupní aktivitu korigovat na čas měření značeného nHAp.

Povrchově značené nHAp byly získány s výtěžky 80–95 %. Ve druhém případě značení byly objemově značené nHAp připraveny ve výtěžku 90–97 % (²²³Ra) a ve výtěžku 93–97 % (^99mTc).

Procento uvolněné aktivity v daném intervalu bylo vypočítáno dle vztahu (2). Získané výsledky jsou uvedeny v grafech. (Obr. 2 a Obr. 3)

Procenta uvolněné aktivity byly ve všech případech pod hranicí 8 %, ve většině případů však nepřesahují hranici 5 %.

Diskuze

Nanohydroxyapatity, stejně tak jako polymerozomy, představují novou generaci potenciálních nosičů jak pro diagnostiku ⁵ tak i terapii ^{6, 7, 8}, zejména však pro cílenou alfa terapii. ^{9, 10, 11} Zvolené radionuklidy pro značení nebyly vybrány náhodně. Radionuklid ²²³Ra je z druhé generace alfa zářičů tzv. in vivo generátorů, kde na jeden rozpad mateřského radionuklidu připadá více alfa a beta částic z rozpadů jeho dceřiných produktů. Kombinací s ^99mTc jakožto diagnostického SPECT radionuklidu by bylo možné získat teranostický nosič.

Výsledky povrchového značení hydroxyapatitů a hydroxyapatitů značených spolusrážením in situ jsou porovnatelné. U povrchově značených je výhodou, že k navázání atomů radionuklidu dochází na materiál předem známý, s ověřenou strukturou a velikostí částic. Charakterizace připraveného materiálu byla provedena pomocí infračervené spektrometrie a rentgenové práškové difrakce, přičemž naměřená data jsou v souladu s dostupnou literaturou. ¹⁴ Navázání/sorpce radionuklidu je tedy poslední krok přípravy značeného hydroxyapatitu. Na druhou stranu u hydroxyapatitů značených spolusrážením je radionuklid začleněn do jejich struktury, kde substituuje ionty Ca²⁺ nebo je uzavřen v intersticiálních polohách. Velikost částic stanovená metodou XRPD odpovídá střední velikosti krystalinitů, nevypovídá však dostatečně o pravé velikosti nanočástic, které poměrně rychle agregují do větších shluků, o čem svědčí i pozorování jejich rychlé sedimentace, kterou zmiňuje i literatura. ⁵ V tomto směru bude zapotřebí zkoumat možnosti stabilizace nanočástic v roztoku, i když velké částice lze, ale za cenu výrazných ztrát aktivity, snadno odstranit filtrací přes standardní 0,22 µm filtr.

V případě ²²³Ra celková uvolněná energie při kaskádě rozpadů na dceřiné radionuklidy představuje přibližně 27 MeV. Energie uvolněná při jednom rozpadu je distribuována mezi emitovanou alfa částici a odražený dceřiný atom, který je následně stabilizován ve struktuře nosiče, adsorbován na povrchu či může dojít k jeho uvolnění. Rozdíly v uvolněné aktivitě v průběhu 5 poločasů (²²³Ra – 11,3 d, ^99mTc – 6 h) jsou téměř zanedbatelné a procenta uvolněné aktivity v prostředí fyziologického roztoku se pohybují pod 8 %, což naznačuje, že pravděpodobně nedochází k významnému uvolňování radionuklidu z nHAp. Supernatant odebraný ze vzorků po povrchovém i objemovém značení v průběhu stabilitních studií ve fyziologickém roztoku neobsahoval podle spektrometrie gama žádný z produktů rozpadu mateřského ²²³Ra, a to i navzdory tomu, že byla očekávána přítomnost izotopu ²¹¹Pb (poločas 36,1 min.). V případě uvolnění dceřiných odražených atomů může zároveň docházet k jejich povrchové sorpci na okolní nanočástice.

Získané výsledky jsou slibným základem pro další studie, zejména pro aplikace in vivo ve zvířecích modelech, ačkoliv další optimalizace přípravy jsou nutné.

Závěr

Výtěžky značení připravených nanohydroxyapatitů se v případě povrchového značení pohybovaly okolo 85 % u značení ²²³Ra a 91 % u značení ^99mTc. Druhý zvolený postup značení byla příprava nanohydroxyapatitů spolusrážením in situ, u kterého výtěžky značení dosahovaly 94 % pro oba zvolené radionuklidy.

In vitro stabilita připravených nHAp byla sledována ve fyziologickém roztoku a byla stanovena uvolněná aktivita v jednotlivých poločasech (dle daného radionuklidu). Procento uvolněné aktivity se pohybovalo pod 8 %, přičemž ve většině případů dokonce nepřesáhlo 5 %.

V budoucích experimentech bude zapotřebí optimalizovat velikost částic a s tím související jejich stabilitu v disperzi, aby nedocházelo k agregaci. Následně provést testy in vitro stability značených nHAp v biologických matricích (krevní plasma a krevní sérum) a tím provést užší výběr nosiče a postup značení pro in vivo experimenty na myších.

Poděkování:

Tato práce byla podpořena grantem Českého vysokého učení technického v Praze č. SGS15/094/OHK4/1T/14, MŠMT ČR č. LK21310 a Technologickou agenturou ČR č. TA03010027. Speciální poděkování patří Ing. Janu Bártovi za XRPD analýzu připravených materiálů.

Petra Mičolová, Martin Vlk, Eva Málková, Anna Bajzíková, Ján Kozempel

Fakulta jaderná a fyzikálně inženýrská, Katedra jaderné chemie, ČVUT v Praze, ČR

jan.kozempel@fjfi.cvut.cz