Průzkumný vrt: jak správně připravit, provést a vyhodnotit séroprevalenční studii

Overview

Séroprevalenční studie jsou významným nástrojem umožňujícím zjistit, jaká část populace již byla infikována (např. SARS-CoV-2). Bez těchto informací je pro státní instituce velmi obtížné přijímat správná protiepidemická opatření. Na jaře 2020 proběhla v jižních Čechách, v okresech Strakonice a Písek, středně velká séroprevalenční studie. Vyšetřeno bylo celkem 2011 lidí, a to ve skupině dobrovolníků z řad veřejnosti a vybraných profesních skupin. Stanovení protilátek IgA a IgG proti koronaviru bylo provedeno metodou ELISA Euroimmun.

Zjistili jsme, že v květnu 2020 mělo protilátky proti koronaviru 2,9 % obyvatel okresu Strakonice a 1,9 % obyvatel okresu Písek. Na jednu osobu s pozitivním testem PCR tedy připadlo dalších nejméně 50 osob s protilátkami proti koronaviru.

Při provádění séroprevalenčních studií je potřeba řešit 3 základní problémy. Je nutné dobře studii naplánovat a promyslet, jaké varianty výsledků lze očekávat. Také vybrat kvalitní testy známých parametrů, které umožnují kvalifikovaně odhadnout podíl falešně pozitivních a falešně negativních výsledků. V neposlední řadě musíme umět data rozumně vyhodnotit a vyvodit z nich správné závěry a zobecnění.

Na konkrétním případě séroprevalenční studie z Jihočeského kraje dále ukazujeme, jak správně řešit případné komplikace, které mohou nastat při takto rozsáhlém testování.

Klíčová slova:

séroprevalence – SARS-CoV-2 – COVID-19 – protilátky – IgG – IgA – česká studie

ÚVOD

Pandemie COVID-19, onemocnění, jehož původcem je nový koronavirus, postihla značnou část světové populace. Od konce prosince 2019 do 24. listopadu 2020 bylo celosvětově potvrzeno asi 58,9 milionu infekcí SARS-CoV-2 a přibližně 1,4 milionu lidí onemocnění COVID-19 podlehlo (1). V Česku byla ke stejnému datu zjištěna SARS-CoV-2 pozitivita asi u 500 tisíc osob, v souvislosti s COVID-19 zemřelo v naší zemi k tomuto datu 7500 osob (2).

Osoby s infekcí prokázanou testy PCR představují pouze špičku ledovce, jelikož velká část infikovaných osob není detekována (3). Z celosvětových dat vyplývá, že 10–20 % z PCR pozitivních osob má závažný průběh onemocnění vyžadující hospitalizaci, 60 % má mírný až středně závažný průběh a je léčeno v domácích podmínkách a přibližně 20 % osob je asymptomatických. Na základě metaanalýzy dat z 23 séroprevalenčních studií, kterou provedl profesor John Ioannidis ze Stanfordovy univerzity v USA, se pravděpodobnost úmrtí u osob s infekcí (infection fatality rate) pohybovala v rozmezí 0,02–0,86 % (medián 0,26 %), přičemž u pacientů mladších 70 let dosahovala pouze 0,00–0,26 % (medián 0,05 %) (4).

Pro správné nastavení epidemiologických opatření v kolektivních zařízeních či firmách nebo pro plánování opatření v celokrajském či celostátním měřítku je třeba vědět, kolik lidí je potenciálně ohrožených, protože se s infekcí ještě nesetkalo, a kolik lidí naopak už infekci prodělalo a je imunních. V rámci séroprevalenčních studiích provádíme jakýsi průzkumný vrt do populace, při kterém stanovujeme podíl osob s protilátkami proti danému mikroorganismu. Kvalita séroprevalenčních studií závisí na tom, jaký test použijeme, jak vybíráme testovanou kohortu a jestli ze získaných dat umíme vyvodit správné závěry.

TYPY STUDIÍ

Séroprevalence (tedy prevalence protilátek v populaci) se liší mezi jednotlivými lokalitami či věkovými, profesními nebo i sociálními skupinami obyvatel. Proto je nutné správně naplánovat výběr skupiny podle účelu studie. Pokud bychom chtěli získat data, ze kterých lze usuzovat na séroprevalenci celé populace, pak by musel být výběr osob proveden tak, aby odpovídal složení populace, podobně jako například při průzkumech volebních preferencí. Know-how k tomuto typu studií má Český statistický úřad. Takové studie, uskutečněné na skutečně reprezentativním vzorku, jsou organizačně velmi náročné, příkladem jsou práce provedené ve Španělsku nebo v ženevském kantonu ve Švýcarsku (5, 6).

Nejčastěji séroprevalenční studie zahrnují skupiny dobrovolníků. V Česku byla takto koncipována celostátní studie SARS-CoV-2-CZ-Preval (zkráceně PREVAL), která zahrnovala data více než 26 tisíc dobrovolníků (7). Často se séroprevalenční studií monitoruje situace po vyřešení nějaké významné epidemiologické situace, jako tomu bylo například v německém Gangeltu, kde došlo k rozšíření epidemie po karnevalových oslavách (8). Epidemií koronaviru bývají zasažené i velké pracovní kolektivy. Mezi zajímavá séroprevalenční šetření uskutečněná ve firmách patří např. studie z chorvatské společnosti DIV provedená ve dvou pobočkách ve Splitu a v Šibeniku nebo ze společnosti Infraserv Höchst v německém Frankfurtu nad Mohanem (9, 10).

Velmi rizikovou skupinu, pokud se jedná o nákazu koronavirem, tvoří zdravotníci. Proto je plánována celá řada studií ve zdravotnických zařízeních. Účelem je jednak zabránit vzniku ohnisek infekce mezi zdravotníky, ale také zjistit, kdo ze zaměstnanců již je vůči infekci odolný a kteří zaměstnanci ještě imunní nejsou. Těchto studií proběhla v České republice celá řada, ale málo z nich bylo publikováno. V rámci Severočeské imunologické konference, která se konala v září 2020 v Ústí nad Labem, byla zveřejněna data ze séroprevalenční studie z Fakultní nemocnice Plzeň (11), ale diskutovalo se o výsledcích průzkumů, které probíhají v Praze v Thomayerově nemocnici a Fakultní nemocnici Motol. Séroprevalence byla zjišťována také u zaměstnanců klinik asistované reprodukce Future Life (12) či na gastroenterologickém oddělení klinického a výzkumného centra ISCARE, a. s., Praha (13). Stanovení protilátek bylo provedeno i v rámci tzv. stomatologické studie, která proběhla v zařízení Skutečný zubař, Praha. Tato studie byla zmíněna v dokumentu Strategie testování onemocnění COVID-19, ale zatím nebyla publikována v odborném tisku (14).

Jiným velmi důležitým typem séroprevalenčních studií jsou „case reporty“ popisující průběh epidemie, která postihla uzavřené komunity, např. domovy seniorů. Příkladem je studie provedená v Domově se zvláštním režimem v Břevnici (15). Pro úplnost bychom měli zmínit i studie séroprevalence u dárců krve, např. z Německa či Itálie, kde byly protilátky stanoveny metodou ELISA nebo testy neutralizačních protilátek (16, 17), ale několik studií bylo provedeno i rychlotesty.

CÍL – UPOZORNIT NA ÚSKALÍ SÉROPREVALENČNÍCH STUDIÍ

Tento text byl napsán v době, kdy v České republice probíhal boj proti druhé, o mnoho závažnější vlně koronavirové epidemie. Bez přehledu o séroprevalenci v jednotlivých regionech a v různých skupinách osob je velmi obtížné situaci řešit. Státní orgány překvapuje vývoj situace, reagují pozdě nebo činí kroky, které se mohou s odstupem času ukázat buď jako zbytečné, nebo naopak nedostatečné. Je tedy velmi žádoucí, abychom se z této situace poučili a abychom v co možná v nejkratší době po zvládnutí aktuální zdravotnické krize provedli nové séroprevalenční studie. Nejsou tak složité, aby je nezvládly uskutečnit klinické laboratoře ve spolupráci s poučeným imunologem a statistikem, ale je potřeba dobře znát jejich úskalí. Na příkladu středně velké séroprevalenční studie chceme ukázat správnou metodickou přípravu a postup při zpracování výsledků. Ukážeme také řešení některých komplikací, které mohou nastat při jejich zpracování.

Účelem jihočeské studie bylo určit séroprevalenci protilátek proti SARS-CoV-2 ve vybraných skupinách obyvatel v okrese Písek a Strakonice. Smyslem tohoto textu je nejen seznámit čtenáře s výsledky studie, ale hlavně upozornit na tři okruhy problémů, na které je třeba dávat pozor při organizaci podobných projektů. Jednak musíme studii dobře naplánovat a dopředu promyslet, jaké výsledky můžeme očekávat a co bychom se z těchto výsledků mohli dozvědět. Dále je nutné vybrat kvalitní testy známých parametrů, které nám umožní správně odhadnout podíl falešně pozitivních a falešně negativních výsledků. V neposlední řadě musíme umět rozumně vyhodnotit získaná data a vyvodit z nich správná zobecnění a závěry.

JIHOČESKÁ STUDIE

Vyšetřovaný soubor

Ve studii bylo vyšetřeno 1011 osob v okresu Strakonice a 1000 osob v okresu Písek (tedy 1,43 %, resp. 1,40 % všech obyvatel okresu). Studijní populaci tvořili skupina dobrovolníků a zástupci profesních skupin, konkrétně hasiči, policisté, řidiči v dopravních službách, úředníci, zdravotníci, zaměstnanci obchodů, pracovníci v sociálních službách, pracovníci městských služeb, úředníci a pracovníci ve školství. Výběr profesí se mírně lišil mezi Strakonicemi a Pískem. Zařazení lidé v době koronavirové epidemie chodili do práce, byli tedy potenciálně exponováni virové nákaze.

Dobrovolníci se hlásili prostřednictvím webových portálů strakonické a písecké nemocnice. Z přihlášených byl vybrán soubor osob odpovídající demografickému složení obyvatel okresů. Mezi zařazovací kritéria patřily věk 5–89 let, nepřítomnost akutních zdravotních potíží, nepřítomnost potvrzené diagnózy COVID-19 metodou PCR, trvalý pobyt nebo výkon povolání v daném okresu, podepsaný informovaný souhlas se studií a se zpracováním osobních údajů a vyplnění dotazníku. Dotazníky bylo zjišťováno, zda se u účastníků v době od ledna do začátku května vyskytly nějaké z příznaků respiračního onemocnění (teplota nad 37,5 °C, rýma, kašel, dušnost, ztráta čichu či chuti, velká únava).

Epidemiologické pozadí

Studie proběhla ve dvou přibližně stejně velkých okresech – k 1. lednu 2020 žilo v okrese Písek celkem 71 587 obyvatel a v okrese Strakonice 70 772 obyvatel (18). Okresy byly zvoleny na základě epidemiologické situace v Jihočeském kraji dne 12. dubna 2020, kdy v Písku byl nejnižší kumulativní počet osob s prokázanou přítomností SARS-CoV-2 (zachyceno bylo 10 osob, tedy 13,9 PCR pozitivních na 100 000 obyvatel) a ve Strakonicích druhý nejvyšší počet PCR pozitivních osob v kraji (zachyceno bylo 33 osob, tedy 46,6 PCR pozitivních na 100 000 obyvatel) (19). Rozdíl v epidemiologické situaci mezi těmito okresy byl patrný již na počátku epidemie. Ve Strakonicích se stali prvními pacienty čtyři zdravotníci pracující na poliklinice, u nichž byla určena diagnóza 14.‒16. března 2020. Kvůli jejich četným kontaktům došlo k nastartování epidemie. K laboratornímu potvrzení infekce u prvních pacientů v Písku došlo 15. března 2020. V obou okresech významně stoupal počet PCR pozitivních osob do konce března, v dubnu a květnu byl již výskyt nových případů v obou okresech minimální. Ve Strakonicích bylo více hospitalizovaných a jedna osoba v té době v souvislosti s COVID-19 zemřela. V době konání studie (přesněji 10. května 2020) činila kumulativní prevalence PCR pozitivních osob v Písku 15,4 případů/100 000 obyvatel a ve Strakonicích 49,5 případů/100 000 obyvatel (19).

Odběry vzorků a laboratorní metody

Odběry v rámci profesních skupin probíhaly od 4. do 15. května 2020 a zajišťovala je Krajská hygienická stanice Jihočeského kraje. V dobrovolnické je zajišťovala odběrová centra obou nemocnic a probíhaly od 5. do 14. května 2020. Vzorky žilní krve testovaných byly dopraveny do mikrobiologických laboratoří v Písku a ve Strakonicích. Přítomnost protilátek byla zjišťována metodou ELISA Anti SARS-CoV-2 IgA a IgG (společnost Euroimmun, Lübeck, Německo). Hodnocení tohoto testu je semikvantitativní – výsledek poskytuje poměry optické denzity vzorků s optickou denzitou kalibrátoru (tzv. OD ratio). OD ratio < 0,8 znamená test negativní, 0,8–1,1 hraniční a hodnoty > 1,1 značí pozitivitu. V Písku byla ELISA prováděna manuálně a ve Strakonicích analyzátorem DSX (Dynex Technologies, Chantilly, USA), vždy v souladu s pokyny výrobce.

Rozvaha před vyhodnocením výsledků

Podle údajů výrobce uvedených v příbalových informacích (verze 4 z května 2020) mělo stanovení IgG vysokou specificitu (99,6 %) a nižší senzitivitu (94,4 %). Pokud by tedy daná osoba měla zjištěny protilátky IgG, bylo by vysoce pravděpodobné, že prodělala infekci. Nižší senzitivita zvyšuje podíl falešně negativních vzorků, to však v případě nízké prevalence nepředstavuje tak velký problém. Stanovení IgA bylo naopak vysoce senzitivní (98,6 %), ale méně specifické (92 %). Tzn. umožnilo detekovat více pacientů, ale kvůli nižší specificitě nebylo jisté, že všichni mají specifické protilátky proti SARS-CoV-2. Proto je nutné hodnotit výsledky IgA společně s IgG.

Poměr falešně a správně pozitivních výsledků závisí nejen na parametrech testu, ale také na prevalenci. Z tohoto důvodu je vhodné před započetím studie provést matematický odhad pro daný počet osob a vybrané diagnostické soupravy (obr. 1). Pokud máme představu, jak asi by studie měla dopadnout, můžeme včas (tedy ještě v době konání odběrů) odhalit případné chyby.

Konzistence dat

Při práci s každou datovou sadou je velmi žádoucí pokusit se o vizualizaci dat. Pokud totiž při jejich sběru došlo k nějakým technickým problémům, dobrá vizualizace na to dokáže okamžitě upozornit. V případě jihočeské studie bylo zapotřebí zkontrolovat, zda jsou data a) rozumně srovnatelná mezi oběma laboratořemi a b) srovnatelná v rámci jedné laboratoře mezi jednotlivými destičkami, resp. jednotlivými šaržemi použitých souprav. V Písku byly vzorky zpracovány ručně (v prvním kole bylo analyzováno 2× 11 destiček ELISA, 1 sada IgA, 1 sada IgG). Ve Strakonicích byly analýzy provedeny automatem DSX (2× 12 destiček ELISA). Celkem byly použity 4 různé šarže souprav IgG a 4 různé šarže souprav IgA. Obě laboratoře použily alespoň jeden kit od každé šarže. Každý běh analýzy zahrnoval kalibrátor, pozitivní a negativní kontrolu, u nichž byly výrobcem definovány rozsahy hodnot OD ratio či optické denzity. Všechny běhy splnily kritéria validity, tudíž na první pohled nebyl předpokládán žádný technický problém. Domníváme se, že v takovém případě by většina laboratoří nepodnikala žádné další kroky ke kontrole validity dat.

Jihočeská studie však disponovala zkušeným a nedůvěřivým datovým analytikem, který provedl vizualizace dat. Při vizualizaci dat protilátek IgG z laboratoře Strakonice bylo zřejmé, že kalibrátor dosáhl stejných hodnot optické denzity u všech destiček. Podobně stabilně vypadala i data ze stanovení IgA z obou laboratoří. Ale v případě stanovení IgG v Písku se vyskytly odchylky u několika změřených OD kalibrátorů (obr. 2). Minimálně u tří destiček byly hodnoty kalibrátorů nezvyklé. Bohužel jsme nedokázali zpětně zjistit, proč k tomu došlo. V důsledku této chyby byly hodnoty OD ratio u všech změřených vzorků na dané destičce posazeny níže (obr. 2, panel A – žlutá destička), nebo naopak výše (obr. 2, panel A – fialová a černá destička) než na ostatních destičkách. Že šlo skutečně o chybu kalibrátoru, lze doložit tím, že nezkalibrované hodnoty optické denzity (obr. 2, panel B) vykazovaly mnohem menší variabilitu než hodnoty kalibrované. To samozřejmě zcela odporuje smyslu kalibrace.

Abychom tento problém odstranili, z každé destičky jsme vybrali několik vzorků (všechny pozitivní a hraniční a 2–3 negativní), které jsme znovu přeměřili ve druhé laboratoři na automatu DSX. Celkem bylo přeměřeno 50 vzorků, ale díky tomuto kroku jsme byli schopni nově zkalibrovat všech 1000 původních datových bodů. Pro každou destičku byla vypočtena konstanta a s její pomocí spočítány nové rekalibrované hodnoty. Ty se významně nelišily od původních v případě osmi destiček s validními hodnotami kalibrátoru, u tří destiček s atypickým kalibrátorem došlo k významnějšímu posunu hodnot OD ratio (obr. 2, panel C). Po přepočtu se kategorie (negativní, hraniční, pozitivní) změnila u 10 z 1000 píseckých vzorků – z pěti negativních vzorků vznikly hraniční, ze čtyř hraničních se staly pozitivní a z jednoho pozitivního negativní. Nejenže se nám tedy podařilo opravit hodnoty ze tří podezřelých destiček, ale navíc jsme nezávisle v jiné laboratoři ověřili hodnoty na ostatních destičkách.

Z této zkušenosti plynou dvě doporučení:

a) Je velmi žádoucí získaná data vždy rozumně vizualizovat. Mají-li údaje formu čísel či tabulek, lze přehlédnout i výrazné anomálie. Při rozumné vizualizaci lze naopak anomálie odhalit na první pohled.

b) Doporučujeme umísťovat na každou měřenou destičku dva až tři kalibrátory – na začátek, doprostřed a na konec destičky. Případná chyba v měření kalibrátoru v jedné jamce totiž může znehodnotit všechna ostatní měření na dané destičce.

Metodika hodnocení výsledků

V případě virové infekce dochází k tvorbě specifických protilátek. Při sérokonverzi zachycujeme nejprve IgM (jsou detekovány přibližně pátý den od klinických příznaků), poté dochází k izotypovému přesmyku a začnou se tvořit IgA a IgG (3). U většiny pacientů jsou protilátky IgG detekovány dva až čtyři týdny po objevení příznaků infekce. Po prodělané infekci IgM postupně mizí, ale IgA a IgG přetrvávají a plní ochrannou funkci.

Na základě těchto předpokladů jsme výsledky studie hodnotili takto:

• Pozitivní výsledek obou testů (IgA a zároveň IgG) byl považován za důkaz prodělané infekce SARS-CoV-2. Tyto osoby označujeme v souladu s doporučením výrobce jako pozitivní. Riziko souběžné falešné pozitivity dvou testů je velmi malé.
• Negativní výsledek obou testů (IgA a IgG) byl považován za důkaz absence protilátek. Tyto osoby označujeme jako negativní. Pokud u nich k infekci došlo, tak bez aktivace specifické protilátkové imunitní odpovědi. Nelze vyloučit, že u nich byla aktivována nespecifická imunitní odpověď nebo buněčná imunita (3), ale tuto imunitní odpověď jsme nevyšetřovali, zatím nejsou k dispozici vhodné testy. Falešnou negativitu v tomto případě vylučujeme ze stejných důvodů, jaké uvádíme výše.
• Ve všech ostatních případech (hraniční IgG, hraniční IgA, pozitivní IgA a negativní IgG nebo pozitivní IgG a negativní IgA) je třeba nad interpretací výsledků přemýšlet (viz níže) a/nebo získat více informací. Všem osobám s takto nejasným výsledkem bylo doporučeno druhé vyšetření protilátek v odstupu několika týdnů od prvního (jím jsme chtěli ověřit, zda v dalším období došlo k sérokonverzi).

U osob s pozitivním a hraničním testem IgG bylo doporučeno provedení RT-PCR vyšetření. Všechna provedená RT-PCR vyšetření byla negativní, pět osob PCR odmítlo.

Výsledky prvního vyšetření

Výsledky prvního vyšetření, které se konalo v květnu 2020, jsou uvedeny v tab. 1. Celkem 855 (84,6 %) probandů ve Strakonicích a 897 (89,7 %) probandů v Písku bylo negativních, tedy nemělo detekované ani IgG, ani IgA proti koronaviru. Kombinace pozitivních protilátek IgG a současně pozitivních protilátek IgA byla zjištěna u 11 osob ve Strakonicích a u 5 osob v Písku. Tzn. minimální (dolní) odhad séroprevalence ve strakonické kohortě činil 11/1011 (= 1,09 %) a v písecké kohortě 5/1000 (= 0,50 %). Jedná se ovšem pouze o dolní odhad a je nepravděpodobné, že skutečná séroprevalence by byla takto nízká.

I kdyby skutečná séroprevalence byla nulová, analogický výpočet, jak jej uvádí obr. 1, ukazuje, že bychom měli dostat přibližně 80 falešně pozitivních výsledků IgA v každém z okresů. To ovšem napovídá, že většina hraničních hodnot IgA v tab. 1 musí být ve skutečnosti započítána jako pozitivní, jinak by celkový počet pozitivních výsledků IgA byl příliš nízký. To by odpovídalo lepším hodnotám specificity, než uvádí výrobce. Ze stejných důvodů považujeme i všechny hraniční výsledky IgG za pozitivní. Je nutné uvědomit si, že přítomnost protilátek byla u některých osob vyšetřována i několik měsíců po infekci, tudíž mohly poklesnout z původně pozitivních na hraniční hodnoty, a proto si tento přístup při jejich posuzování můžeme dovolit.

Rozumný odhad skutečné séroprevalence v obou kohortách lze získat následovně: Vzhledem k vysoké specificitě testu IgG budeme všechny osoby s pozitivním nebo hraničním výsledkem IgG (bez ohledu na hodnotu IgA) považovat za suspektní pacienty s COVID-19. Jedná se o červeně označené výsledky v tab. 1, tedy o 33 osob ve Strakonicích a 23 osob v Písku. Podle obr. 1 lze při nízkých hodnotách promořenosti očekávat 4 falešně pozitivní výsledky IgG v každém okresu, od hodnot 33 a 23 je tedy odečteme. Reálný odhad séroprevalence ve Strakonicích je tedy (33–4)/1011 = 0,0287, tj. 2,9 %, a v Písku (23–4)/1000 = 0,019, tj. 1,9 %. Falešně negativních hodnot je zanedbatelný počet, proto výslednou hodnotu séroprevalence neovlivní.

Pokud platí, že séroprevalence ve Strakonicích činí 2,9 %, pak očekáváme 29 správně a 80 falešně pozitivních testů IgA, tj. celkem 109 pozitivních testů IgA. Ve skutečnosti bylo zjištěno 139 hraničních a pozitivních testů IgA (58 + 81), což uvedený odhad dokonce poněkud přesahuje. Analogicky při prevalenci 1,9 % v Písku očekáváme 19 správně a 80 falešně pozitivních testů IgA, celkem 99 IgA pozitivit. I v tomto případě změřená data (52 + 37 = 89) přibližně odpovídala očekávaným.

Z této části studie je zřejmý důležitý závěr, že při interpretaci změřených výsledků musíme brát do úvahy falešnou pozitivitu testů. Z výsledků prvního vyšetření protilátek IgG proti SARS-CoV-2 vyplynulo, že séroprevalence ve strakonické kohortě činila 2,9 % (s dolním odhadem 1,09 %) a v písecké kohortě 1,9 % (s dolním odhadem 0,5 %). Testy IgA mají specificitu natolik nízkou, že při rovněž nízké prevalenci představuje většina pozitivních výsledků pozitivitu falešnou.

Ze 36 osob s pozitivními protilátkami IgG 22 (61 %) nereportovalo žádné klinické příznaky. Tím se tato skupina nelišila od celé testované kohorty, v níž neuvedlo žádné příznaky 1151 (57,2 %) jedinců. Pouze 286 (14,2 %) probandů reportovalo více než tři příznaky respiračního onemocnění. Toto zjištění se shoduje s publikovanými informacemi (4, 7).

Klinické příznaky

Část testované kohorty v profesních skupinách (zdravotníci, hasiči, policisté, řidiči autobusů, prodavači atd.) tvořili účastníci s větší expozicí nákaze, u nich jsme tedy předpokládali vyšší séroprevalenci než ve skupině dobrovolníků. Tento předpoklad se ale nepotvrdil. Ve Strakonicích se v obou skupinách vyskytovalo 12 pozitivních osob a v Písku bylo více pozitivních mezi dobrovolníky (8 osob) než v profesních skupinách (4 osoby). Ani mezi jednotlivými profesními skupinami nebyl zaznamenán žádný rozdíl v séroprevalenci.

Výsledky druhého vyšetření

Druhé vyšetření bylo navrženo u osob, které neměly jednoznačný výsledek při prvním odběru (viz výše). Z pozvaných k odběru se někteří nedostavili. Počátkem července (po 6 týdnech) bylo vyšetřeno 38 lidí ve Strakonicích a 65 v Písku. Výsledky opakovaného vyšetření v Písku uvádí obr. 3. Tři jedinci s původně hraničními IgG (osoby označené jako 16, 36 a 40) měly opět hraniční hodnotu IgG, u čtyř probandů s původně negativními hodnotami IgG došlo ke vzestupu na hraniční (osoby označené jako 10, 32, 60 a 65). U 3 z těchto 4 jedinců byly detekovány pozitivní IgA, u jedné došlo k poklesu hladiny IgA na negativitu. Zjištěné nárůsty OD ratio byly bohužel velmi malé. Významné zvýšení bylo zjištěno u pacienta 65, který měl i klinické projevy typické pro koronavirovou infekci. U ostatních osob nebylo možné s jistotou potvrdit, jestli infekci prodělaly nebo neprodělaly.

V případě druhých vyšetření provedených ve Strakonicích (není zobrazeno) skoro všechny hodnoty IgA poklesly, podobně jako v Písku. Tento efekt byl očekávaný, protože k druhému odběru byli pozváni pacienti s hraniční či pozitivní hodnotou IgA. Většina z nich však byla při prvním měření falešně pozitivní (viz oddíl Výsledky prvního vyšetření), a proto u druhého měření byl předpokládán pokles hodnot. Tento efekt je v literatuře znám jako regrese k průměru. Ve Strakonicích jsme nezaznamenali ani jeden případ nárůstu hodnot IgG z negativních na hraniční či pozitivní. Výsledky opakovaného vyšetření nebyly použity k přepočítání séroprevalence z prvního kola. Na základě poznatků o sérokonverzi, které máme k dispozici v současnosti, by opakované vyšetření protilátek případně mělo proběhnout již za 2–4 týdny (20).

ZOBECNĚNÍ VÝSLEDKŮ JIHOČESKÉ STUDIE NA CELOU POPULACI

Výsledky ze skupiny dobrovolníků testované kohorty lze s opatrností použít k odhadu séroprevalence v okresech Písek a Strakonice v květnu 2020. Nejedná se sice o reprezentativní vzorek populace, ale byla dodržena aspoň věková struktura. Studijní populaci tvořenou profesními skupinami nebylo možné použít: jednak její zástupci byli více vystaveni virové infekci, a hlavně se uvnitř skupin mohly vyskytovat velké korelace (členové pracovních týmů se mohli vzájemně nakazit).

V dobrovolnické skupině ve Strakonicích bylo 14 osob s hraničním či pozitivním testem IgG, u 2 z nich se pravděpodobně jednalo o falešnou pozitivitu, 7 mělo pozitivní IgG i IgA. Odhad séroprevalence na úrovni celého okresu byl tudíž 12/518 = 0,023, tj. 2,32 %, s dolním odhadem 7/518 = 0,0135, tj. 1,35 %. V Písku bylo zjištěno 15 osob s hraniční či pozitivní hodnotou IgG, 2 z nich pravděpodobně falešně pozitivní, 5 mělo pozitivní IgA i IgG. Analogický odhad séroprevalence v Písku činil 13/500 = 0,026, tj. 2,60 %, s dolním odhadem 5/500 = 0,01, tj. 1,00 %.

V květnu 2020 dosáhl kumulativní počet PCR-pozitivních osob ve Strakonicích 49 případů a v Písku 15 případů na 100 000 obyvatel. Na 1 případ PCR pozitivity tedy připadlo 47 osob s protilátkami ve Strakonicích a 173 v Písku. Pokud vezmeme v úvahu nižší z těchto čísel, tedy přibližně 50 lidí s protilátkami na jednu osobu s COVID-19 prokázaným PCR testem, pak můžeme velmi zhruba odhadnout také celkový počet lidí, kteří se setkali s infekcí v celé České republice. Při počtu 10 000 pozitivních výsledků PCR testů (vycházíme z počtu v květnu 2020) by se jednalo o půl milionu osob (2).

V té době bylo nahlášeno 300 úmrtí v souvislosti s COVID-19. Smrtnost onemocnění, spočítaná jako poměr počtu zemřelých ku infikovaným, tedy byla 300/500 000, tj. 0,06 %. Tento odhad odpovídá dosud největší séroprevalenční metastudii (4), která uvádí infection fatality rate 0,05 % pro populaci mladší 70 let a 0,26 % při započtení všech věkových skupin.

DISKUSE

Séroprevalenční studie představují velmi důležitý nástroj, umožňující přesněji určit počet osob, které byly infikovány SARS-CoV-2 a vytvořily si protilátky. Bez znalosti séroprevalence je velmi náročné rozhodovat o rozsahu epidemiologických opatření v konkrétním regionu či dané skupině osob.

Tento článek přináší výsledky středně velké séroprevalenční studie, která proběhla v jižních Čechách. V okresech Strakonice a Písek byla metodou ELISA otestována přítomnost protilátek IgA a IgG u celkem 2011 lidí. Studie ukázala, že již v květnu 2020 bylo možné odhadnout, že 2,9 % obyvatel okresu Strakonice a 1,9 % obyvatel okresu Písek mělo protilátky proti SARS-CoV-2. Na jednu osobu s pozitivním PCR testem připadlo v populaci dalších nejméně padesát osob, které pravděpodobně prodělaly infekci.

Aby séroprevalenční studie přinesla kvalitní výsledky, musí splňovat následující předpoklady: a) dobře promyšlený design a správně provedený rozbor očekávaných výsledků, b) použití kvalitních testů se známými parametry a pokud možno s vysokou specificitou a c) správně provedené vyhodnocení získaných dat, zejména s ohledem na počty falešně pozitivních a negativních výsledků. Pokud autoři séroprevalenčních studií jejich přípravu a hodnocení podcení, mohou obdržet překvapivé, zkreslené či naprosto zavádějící výsledky.

V Česku proběhla v dubnu 2020 velká celostátní studie PREVAL, kterou zadávalo Ministerstvo zdravotnictví ČR, realizoval ÚZIS a podílelo se na ní mnoho dalších institucí (7). V jejím rámci byly protilátky vyšetřovány rychlotestem Wantai (Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co., Ltd., Peking, Čína), u kterého výrobce uváděl senzitivitu 95,6 % a specificitu 95,2 %. Testovaná kohorta sestávala převážně z dobrovolníků a testování probíhalo jak v regionech s očekávanou vyšší promořeností (Litovelsko mělo kolem 800 PCR pozitivních na 100 000 obyvatel), tak v regionech s očekávanou nižší promořeností (Brno mělo kolem 40 PCR pozitivních na 100 000 obyvatel). Mezi více než 26 tisíci testovaných osob bylo zjištěno pouze 107 jedinců s pozitivním výsledkem rychlotestu.

Rozborem (analogickým obr. 1) přitom bylo možné jednoduše stanovit, že i při nulové promořenosti by se testem se specificitou 95,2 % mělo z této skupiny získat asi 1300 (falešně) pozitivních výsledků. Získaných 107 pozitivních výsledků by tedy naznačovalo téměř stoprocentní specificitu, což bylo při specificitě deklarované výrobcem vyloučené. Daleko pravděpodobnější je vysvětlení, že vybraný rychlotest nedisponoval dostatečnou citlivostí a drtivou většinu osob s protilátkami nezachytil. Na jaře 2020 měli výrobci nové diagnostické soupravy většinou otestované jen séry hospitalizovaných pacientů s akutní fází COVID-19. Ukázalo se však, že hladina protilátek u nich byla výrazně vyšší než u osob s mírnějším průběhem onemocnění.

V současnosti již víme, že tyto méně citlivé soupravy (zpravidla rychlotesty) nejsou vhodné pro séroprevalenční studie. Je potřeba si uvědomit, že test, který je v daných podmínkách téměř nefunkční, charakterizuje velmi nízká senzitivita, ale téměř stoprocentní specificita. Podle názoru autorů tohoto textu jsou tedy výsledky studie PREVAL nevalidní a o skutečné séroprevalenci neposkytují téměř žádné informace. Součástí návrhu studie PREVAL bylo přetestování všech vzorků sér odebraných v Olomouci a Litovli přesnějšími laboratorními metodami, což by umožnilo zpětně odhadnout skutečné parametry rychlotestů. Výsledky tohoto měření stále nejsou k dispozici.

Asi největší evropská séroprevalenční studie byla provedena ve Španělsku na přelomu dubna a května 2020 a zahrnula více než 60 tisíc obyvatel (5). Metodou dvoustupňového stratifikovaného výběru byly zařazeni účastníci z celé země, a to jak v těžce zasažených oblastech, tak v lokalitách s menším počtem pacientů s COVID-19. Výzkumníci použili dva testy – rychlotest Orient Gene Biotech COVID-19 IgG/IgM Rapid Test Cassette (Zhejiang, Čína) a sérologické vyšetření protilátek IgG proti nukleoproteinu SARS-CoV-2 chemiluminiscenční metodou (Architect, Abbott Laboratories, USA).

Senzitivita a specificita obou testů, kterou si tým ověřil i vlastní verifikační studií, činily 82,1 %, resp. 100 % u rychlotestu a 89,7 %, resp. 100 % u chemiluminiscence. Výsledky obou metod spolu velmi dobře korelovaly, podíl pozitivních záchytů byl v případě obou testů podobný. V nejvíce postižených oblastech v centrálním Španělsku výzkumníci zjistili séroprevalenci 10,0–14,4 %, v celé zemi bylo zjištěno průměrně 5 % osob s protilátkami. V madridské metropolitní oblasti se v době zahájení studie nacházelo 0,94 % lidí s diagnostikovaným COVID-19 (62 tisíc PCR pozitivních osob z 6,5 milionu obyvatel) (21). Při séroprevalenci 11,5 % tedy bylo koronavirovou infekcí nakaženo dalších přibližně 900 tisíc lidí jen v této oblasti.

Ve stejné době proběhla studie v kantonu Ženeva ve Švýcarsku (6). I zde byl testován reprezentativní vzorek populace. Vyšetření podstoupily téměř 3000 účastníků, a to v průběhu pěti týdnů (každý týden část skupiny). Ukázalo se, že séroprevalence týden od týdne rostla, konkrétně od 4,8 % do 10,8 %. Protilátky IgG se stanovovaly metodou ELISA Euroimmun, tedy stejnou jako v naší studii. V době konání studie bylo v ženevské oblasti 1 % obyvatel s diagnostikovaným COVID-19 (5000 PCR pozitivních osob z půl milionu obyvatel), tzn. zasažen byl stejný podíl populace jako v madridské oblasti.

V německém Gangeltu byla po epidemii, k níž došlo v únoru po karnevalových oslavách, zjištěna koronavirová infekce u 2,69 % tamních obyvatel (340 PCR pozitivních osob z 12,6 tisíce). V březnu bylo vyšetřeno 900 lidí metodou ELISA Euroimmun a 15,5 % z nich mělo protilátky (8). Séroprevalenci v méně zasažených lokalitách Německa stanovila jiná studie, opět metodou ELISA Euroimmun: u 3000 dárců krve byla zjištěna séroprevalence 0,91 %, což lze považovat za dolní odhad v nejzdravější populaci (16). S těmito výsledky je srovnatelná i jarní dvouprocentní séroprevalence zjištěná v Písku a Strakonicích v době velmi nízkého výskytu infekce v těchto okresech.

V době finalizace publikace (24. listopadu 2020) bylo v Jihočeském kraji hlášeno 32 tisíc potvrzených případů COVID-19 (19), což při 644 tisících obyvatel představovalo 4,97 % populace, tedy výrazně více, než bylo na jaře v ženevské či madridské oblasti. Z kapacitních důvodů není možné nyní ani v dohledné době zorganizovat novou séroprevalenční studii, proto skutečný rozsah podzimní epidemie zjistíme až po jejím zvládnutí.

ZÁVĚRY A DOPORUČENÍ PRO PLÁNOVÁNÍ SÉROLOGICKÝCH STUDIÍ

• Před začátkem studie je potřeba provést rozbor situace s ohledem na očekávaný poměr skutečně a falešně pozitivních a negativních výsledků testů.
• Je třeba, aby parametry použitých testů byly dobře známé a testy byly předem vyzkoušené na populaci, kterou jimi hodláme vyšetřovat.
• Při nízké séroprevalenci je důležité dbát na vysokou specificitu použitých testů, abychom se neutopili v moři falešně pozitivních výsledků.
• Získaná data je vhodné vždy rozumně vizualizovat, aby byly viditelné případné anomálie.
• Doporučujeme používat dva až tři kalibrátory či jiné kontrolní vzorky v každém testu, aby případná chyba v měření jedné jamky s kalibrátorem neznehodnotila všechna měření na dané destičce.
• Atypické výsledky lze objasnit opakovanými měřeními provedenými v odstupu 2–3 týdnů od prvního měření, případně použitím jiného testu.
• Pokud se studie účastní více laboratoří, je vhodné přeměřit některé vzorky z jedné laboratoře v jiné laboratoři a získat jistotu stran kvality a srovnatelnosti dat.
• Při interpretaci výsledků je nutné nezapomínat na to, že realita je jedna věc a její obraz získaný testy věc druhá. Při větším počtu vyšetřovaných osob se vždy objeví jak jedinci, kteří ve skutečnosti protilátky mají, ale test je nenajde, tak jedinci, kteří ve skutečnosti protilátky nemají, ale test jim přesto vyjde pozitivně. Vždy je zapotřebí správně počítat s falešně pozitivními a falešně negativními výsledky.

Poděkování

Jihočeská séroprevalenční studie byla financována zadavateli studie, tedy hejtmanstvím Jihočeského kraje a firmou OIG POWER, s. r. o.

Autoři (T. Fürst a J. Strojil) děkují Grantové agentuře České republiky za podporu projektem GA19-17474S: Bayesovské usuzování jako prostředek pro efektivní znalecké dokazování v civilním soudním řízení.

Čestné prohlášení

Autoři práce prohlašují, že v souvislosti s tématem, vznikem a publikací tohoto článku nejsou ve střetu zájmů a vznik ani publikace článku nebyly podpořeny žádnou farmaceutickou firmou ani zadavatelem studie.

Seznam zkratek

COVID-19         coronavirus disease 2019

ELISA    enzyme-linked immunosorbent assay

IgA, IgG, IgM    imunoglobuliny A, G, M

PCR       polymerázová řetězová reakce

SARS-CoV-2     severe acute respiratory syndrome coronavirus 2

Adresa pro korespondenci:

RNDr. Zuzana Krátká, Ph.D.

Imunologická laboratoř GENNET, s. r. o.

Na Poříčí 26, 110 00  Praha 1

Tel.: 242 456 845

e-mail: zuzana.kratka@gennet.cz