Moderní metody v diagnostice a výzkumu genetických příčin vzácných onemocnění
Authors:
Stanislav Kmoch 1,2; Jiří Zeman 1
Authors‘ workplace:
Klinika dětského a dorostového lékařství 1. LF UK a VFN v Praze
1; Laboratoř pro studium vzácných nemocí, Národní centrum lékařské genomiky, 1. LF UK
2
Published in:
Čas. Lék. čes. 2018; 157: 133-136
Category:
Overview
Vzácná onemocnění představují skupinu 8000 různých nemocí postihujících zhruba 8 % populace. Studium genomů významně zvyšuje znalosti o genetické variabilitě člověka a pomocí efektivního sdílení dat v mezinárodních registrech umožňuje kauzální diagnostiku širokého spektra vzácných onemocnění u cca 55–65 % nemocných. Diagnostika zbývajících pacientů závisí na nových technologiích a konceptech studia lidských genomů, které se zaměřují na genetickou a funkční analýzu genetických variant a jejich kombinací s cílem rozpoznat genetickou heterogenitu jednotlivých nemocí, přítomnost somatického mozaicismu, existenci fenokopií, různé penetrance a expresivity jednotlivých mutací a oligogenních typů dědičnosti. Stoupá význam analýz nekódujících oblastí lidské DNA a studium jejího vlivu na transkripci a strukturu mRNA a analýzy repetitivních a homologních oblastí lidského genomu a interpretace jejich variability. Při hledání genetické příčiny vzácných nemocí je třeba cíleně analyzovat biologické tekutiny, tkáně i vhodné buněčné a zvířecí modely připravované metodami buněčného reprogramování nebo cílených změn genomu.
Přinášíme stručný přehled metod, které zahrnují celoexomové a celogenomové sekvenování nové generace, funkční a homologní klonování, funkční komplementaci, mapování genů pomocí vazebné analýzy a porovnávání genomové informace jedince nebo skupiny jedinců s genetickou variabilitou populace. Exomovou analýzu jsme provedli u více než 520 pacientů s diagnostickou úspěšnosti nad 50 %. Srovnáním vlastních výsledků celoexomového sekvenování s výsledky cíleného sekvenování jsme v souboru 225 nemocných došli k závěru, že diagnosticky i ekonomicky je smysluplnější indikovat celoexomové a v blízké budoucnosti celogenomové sekvenování.
Moderně koncipovaná diagnostika a výzkum vzácných nemocí je časově, personálně i finančně náročná a vyžaduje spolupráci lékařů s pracovišti biologicky orientovaného výzkumu. Jejich nezbytnost pro české zdravotnictví představuje výzvu pro organizátory i plátce českého zdravotnictví a výzkumu.
Klíčová slova:
vzácná a komplexní onemocnění, celoexomové sekvenování, mapování genů
Studium vzácných nemoci – unikátní možnost poznání genetické variability člověka
Vzácná onemocnění představují skupinu cca 8000 různých nemocí, která jsou obvykle způsobena mutacemi v jednom nebo několika málo genech (monogenní nebo oligogenní dědičnost). Ačkoliv výskyt jednotlivé vzácné nemoci je v populaci nízký (< 1 : 2000), jako skupina jsou relativně časté (1) a postihují 7–8 % populace. Klinicky se mohou projevit v kterémkoliv věku různě závažnými příznaky. Jejich diagnostika je však obtížná, protože výsledky většiny biochemických vyšetření jsou nespecifické. Přitom neznalost etiopatogeneze nemoci může mít negativní dopad nejen na léčbu, ale i na genetické poradenství v postižených rodinách.
Pouze určení kauzálních patogenetických mechanismů představuje základ diagnostiky, je východiskem pro kvalifikované genetické poradenství a je nutným předpokladem pro aplikaci či vývoj nových terapeutických postupů. Výzkum vzácných geneticky podmíněných nemocí přináší i nové možnosti pro efektivní studium biologie člověka, například při vysvětlování funkce různých genů, patofyziologických procesů v lidských buňkách a tkáních i metabolických a regulačních pochodů účastnících se rozvoje komplexních nemocí (2).
Vývoj metodických přístupů k určení kauzálních genů a mutací u vzácných nemocí
Identifikace kauzálních genů a mutací podmiňujících vzácná nemocí byla nejprve založena na asociaci studovaného fenotypu s biochemicky určenou kvalitativní nebo kvantitativní změnou některého proteinu (3), případně změnou jeho aminokyselinové sekvence (4). Některé z biochemických fenotypů byly pomocí vazebných studií, analýzy hybridních somatických buněk, delečního mapování, hybridizačních studií nebo asociací s mikrodelečními syndromy lokalizovány na chromozomální genetické mapy.
Dostupnost metod izolace a sekvenování proteinů, přípravy protilátek, syntézy oligonukleotidů, technik rekombinantní DNA a DNA sekvenování umožnila klonování jednotlivých genů či jejich fragmentů z genomových (gDNA) a komplementárních (cDNA) knihoven. Toto funkční klonování bylo poprvé úspěšně využito při identifikaci genu pro koagulační faktor VIII (5) a následně pro poznání celé řady dalších protein kódujících genů. Zvyšující se znalost sekvencí a funkcí jednotlivých genů a určování jejich mutací ve vztahu ke konkrétním nemocím byla podmínkou homologního klonování. Tento přístup umožnil definovat skupinu neurodegenerativních onemocnění podmíněných počtem repetetivních sekvencí a určit funkci u řady buněčných transportérů, kanálů, receptorů, enzymů i transmembránových a strukturálních proteinů. Identifikaci řady kauzálních genů umožnila dostupnost panelů somatických hybridů, cDNA a gDNA knihoven a postupy funkční komplementace buněčných kultur od pacientů se vzácnými poruchami. Základním předpokladem pro úspěch byla znalost biochemického, biologického, případně histopatologického fenotypu onemocnění, což splňuje pouze malá část ze vzácných nemocí.
Charakterizaci a studium vzácných nemocí bez známé biochemické či biologické příčiny umožnil objev polymorfních proteinových markerů, délkových polymorfismů restrikčních fragmentů (RFLP) a koncept mapování genů pomocí vazebné analýzy (6), který vedl na konci 80. let k určení chromozomální lokalizace genů pro Huntingtonovu nemoc, chronickou granulomatózu, cystickou fibrózy atd. (7). Postupy pozičního mapování byly významně urychleny po objevu polymorfních mikrosatelitních (STR) markerů a konstrukce nových generací genetických map a díky vývoji výpočetních programů pro vazebnou analýzu. Fyzickou izolaci a charakterizaci jednotlivých genů usnadnilo klonování rozsáhlých oblastí DNA v podobě artificiálních chromozomů, rozšíření spektra metodických přístupů pozičního klonování, existence veřejně dostupných dat generovaných v rámci projektu sekvenace celého lidského genomu a sekvenace cDNA klonů (ESTs). Technologický vývoj při studiu lidského genomu a zkušenosti s rozsáhlými knihovnami cDNA a gDNA klonů vedly k vývoji zcela nových technologických prvků, které zvýšily sekvenační kapacity a snížily finanční náklady této metody. Byly připraveny první cDNA arraye a litograficky vyráběné oligonukleotidové čipy. Zvyšující se dostupnost sekvenování začala odkrývat genetickou variabilitu člověka na úrovni jednotlivých nukleotidů. To umožnilo definovat skupiny jednonukleotidových polymorfismů (SNPs – single nucleotide polymorphisms) a připravit jejich rozsáhlé databáze (dbSNP). Významně postoupil i vývoj bioinformatických nástrojů, které umožňují současné zpracování desetitisíců genotypů pro účely vazebné analýzy a rekonstrukce haplotypů. Postupně vznikaly integrované databáze a on-line prohlížeče (např. Map Viewer, ENSEMBL nebo UCSC genome), což umožnilo odhalit genetické příčiny několika tisíc dědičně podmíněných nemocí (8).
Nové metody analýzy genomu a genetická variabilita člověka
Systematickou analýzu genomů umožnila technologie DNA čipů odhalujících široké spektrum strukturních variant (CNV – copy number variation) a nové metody sekvenování pomocí panelu vybraných genů, případně sekvenování všech oblastí genomu kódujících protein (sekvenování exomu) nebo sekvenování celého genomu. Postupně se zvyšující počet analýz u zdravých i nemocných osob ukázal na obrovskou genetickou variabilitu člověka i celých populací. V roce 2002 začal mezinárodní projekt HapMap, který určil haplotypovou strukturu lidského genomu (určení úseků genomu, které nepodléhají meiotické rekombinaci a jsou děděny pospolu, haplobloků) (9). Na tento projekt navázal projekt 1000 genomů, jehož databáze (10) obsahovala informace o existenci a frekvenci více než 84 milionů SNPs, 3,6 milionu krátkých inzercí a delecí (indels) a 60 000 CNVs u více než 2500 jedinců z 26 populačních oblastí. Významnou databází je The Exome Aggregation Consortium (ExAC) poskytující informace o genetické variabilitě sekvencí kódujících protein (exomu) u 60 000 nepříbuzných jedinců sekvenovaných v rámci projektů zaměřených na vybrané typy nemocí (11). Jejím pokračováním je The Genome Aggregation Database (gnomAD), která poskytuje informace o 123 000 exomech a 15 000 genomech.
V současných databázích jsou dostupné i informace o frekvencích genetických variant různých populací od evropské až po africkou, afroamerickou či východo- a jihoasijskou, které ukazují na specifickou genetickou odlišnost historicky či kulturně různých skupin lidí. Vznikají i národní a regionální databáze genetických variant, které lze používat při diagnostice onemocnění s častějším výskytem v určité populaci. V ČR je to veřejně dostupná národní databáze pod záštitou Národního centra lékařské genomiky (www.ncmg.cz). Obsahuje varianty běžné pro českou populaci a do konce roku 2018 by měla mít 1000 vzorků.
Analýza genomů jako nástroj identifikace kauzálních genů a mutací u vzácných nemocí
Aplikace metod podrobné analýzy genomu u osob se vzácným onemocněním umožňuje porovnat genomové informace pacienta nebo skupiny jedinců s genetickou variabilitou populace a odhalit populačně vzácné či unikátní genetické odchylky. Při interpretaci nalezených variant je nutno hodnotit, zda se jedná o fenotyp dominantní, recesivní, vzniklý de novo nebo se jedná o somatickou mutaci. Význam má mezidruhová sekvenční konzervovanost studovaného genu a předpokládaný vliv varianty na funkci. Postupně se vymezuje menší počet kandidátních genů/variant, které mohou být hledávány pomocí databáze GeneMatcher (12) nebo analyzovány u dalších pacientů s podobným onemocněním či nejlépe studovány pomocí funkčních testů in vitro či in situ. Významnou pomoc při určování kandidátních genů poskytují i paralelně prováděné vazebné analýzy nebo analýzy genové exprese v tkáních či tkáňových kulturách. Úspěšnost se na základě zkušeností našeho i dalších pracovišť pohybuje okolo 50 %. U nevyřešených případů je nutno uvažovat o existenci mutací přítomných v genomových oblastech, které se současnými metodami nedají sekvenovat (13) nebo o multialelickém modelu dědičnosti. Zvláštní kapitolu představují somatické mutace a transgenerační genetické vlivy včetně imprintingu. Nové technologie přináší i řadu problémů, například při nálezu dosud nepopsané genetické varianty nebo jejich kombinace, jejichž faktický dopad na fenotyp není snadné interpretovat. Jsou to genetické varianty neznámého významu (VUS – variants of unknown significance). Pro jejich objasnění je nutné využít systematické studium buněčných modelů (tkáňové kultury, embryonální kmenové buňky (ESC), imortalizované kmenové buňky (iPSC) nebo zvířecí modely. Významnou pomoc poskytuje komparativní patologie, která se zabývá buněčnou, tkáňovou a orgánovou patologií vzácných nemocí v lidských tkáních a myších modelech. Důležitá je i cílená a necílená metabolomická analýza, která sleduje změny metabolitů v tělních tekutinách, buněčných kulturách a tkáních u pacientů i modelových organismů.
Etické aspekty
Všechna molekulární vyšetření probíhala po informovaném souhlasu pacienta. Studie byla schválena společnou etickou komisí 1. LF UK a VFN.
Vlastní zkušenosti s výzkumem a diagnostikou vzácných onemocnění
Našemu pracovišti na Klinice dětského a dorostového lékařství a v Národním centru lékařské genomiky na Karlově se průběhu posledních 10 let podařilo určit kauzální geny a objasnit molekulární podstatu onemocnění u řady vzácných nemocí, mezi které patří porucha adenylosukcinátlyázy (ADSL) (14), krystalická katarakta (gamma-D krystalin) (15), mukopolysacharidóza IIIC (TMEM76) (16), porucha syntázy ATP (TMEM70) (17), familiární hyperurikemická nefropatie [uromodulin (18), renin (19), SEC61A1 (20)], neuronální ceroidní lipofuscinóza 4 (DNAJC5) (21), Rotorův syndrom (kombinovaný defekt OATP1B1 a OATP1B3) (22), syndrom GAPO (ANTXR1) (23), medulární cystická nemoc ledvin (mucin-1) (13), X-vázaná forma hypertrofické kardiomyopatie (FHL1) (24), porucha glykosylace proteinů na úrovni Nogo-b receptoru (25), Oliverův-McFarlaneův syndrom (PNPLA6) (26), polymorfní dystrofie rohovky [OVOL2 (27) a GRHL2 (28)], akadianská forma Fanconiho syndromu (29) a neurodegenerativní onemocnění neznámé etiologie (VPS15) (30). Exomovou analýzu jsme provedli u více než 520 pacientů z 80 rodin. Diagnostická úspěšnost se pohybuje nad 50 %. Srovnáním vlastních výsledků celoexomového sekvenování s výsledky cíleného sekvenování pomocí panelů vybraných genů jsme v souboru 225 nemocných došli k závěru, že ve většině případů je diagnosticky i ekonomicky výhodnější indikovat celoexomové sekvenování.
V současné době se samostatně nebo v široké české a mezinárodní spolupráci podílíme na:
- studiu vzácných nemocí s cílem diagnostikovat a definovat nové a klinicky relevantní kandidátní geny a varianty,
- efektivní přípravě buněčných modelů a modelových organismů pro vybrané fenotypy,
- analýze patofyziologických mechanismů vedoucích k rozvoji vzácných nemocí,
- vyhledávání biomarkerů pro diagnostiku a studium patogeneze vzácných nemocí,
- vývoji metod pro analýzu vybraných biomarkerů a fenotypů pro následný screening vybraných vzácných onemocnění,
- snahách o ovlivnění patologických stavů v modelových systémech a na přípravě nových léčebných metod.
Základním metodickým nástrojem je analýza genomu, kterou provádíme v rámci Národního centra lékařské genomiky (NCLG). To je koncipováno jako výzkumná infrastruktura genomických laboratoří 1. a 2. LF UK a LF UK v Plzni, Všeobecné fakultní nemocnice v Praze, Fakultní nemocnice v Motole, Biotechnologického a biomedicínského centra Akademie věd a Univerzity Karlovy ve Vestci ( BIOCEV), Interní hematoonkologické kliniky, Centra molekulární biologie a genové terapie Lékařské fakulty Masarykovy univerzity, FN Brno, Středoevropského technologického institutu (CEITEC) Masarykovy univerzity v Brně a Ústavu molekulární a translační medicíny Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci a FN Plzeň (www.ncmg.cz). Cílem NCLG je zabezpečit provoz nejmodernějších sekvenačních platforem a navazujících technologií pro analýzu lidského genomu a přispět ke zlepšení biomedicínského výzkumu a translační medicíny v ČR. Kromě jiného se podílíme na analýzách vzácných genetických variant s potencionálním dopadem na rozvoj komplexních fenotypů, mezi které například patří impulzivní násilí, statiny indukovaná myopatie, srdeční selhání. Vycházíme z konceptu genomiky klanu (31), který předpokládá, že komplexní nemoc je skupinou různých nemocí způsobených několika variantami v genech, které se podílí na biologii orgánů či tkání.
Motivace lékařů ke genetickému výzkumu a Národní centrum lékařské genomiky jako univerzální platforma pro studium geneticky podmíněných nemocí v různých oborech medicíny v ČR
Základním předpokladem úspěchu a pokroku při studiu vzácných a komplexních nemocí je motivace a aktivní přístup lékařů a klinických pracovišť. Genetický výzkum je založen na úzké spolupráci odborníků s pacienty a jejich rodinami. Ošetřující lékař je v kontaktu s pacienty, interpretuje biochemická vyšetření a zprostředkovává komunikaci mezi požadavky výzkumné laboratoře a pacientem. V dnešní éře internetu může motivovaný lékař ale i pacient snadno nalézt specializovaná pracoviště, která se problematice konkrétní vzácné nemoci věnují. Lékař a pacienti jsou tak hlavními iniciátory genetického/genomického výzkumu a následně i uživateli výsledků výzkumné práce.
Poděkování
Práce shrnuje výsledky, kterých bylo dosaženo díky úsilí desítek kolegů a řady grantů. Výzkumný rámec zmíněných studií byl umožněn díky existenci a podpoře vědecké infrastruktury Národního centra lékařské genomiky (LM2015091) a jeho projektu zaměřeného na vytvoření referenční databáze genetických variant České republiky (CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001634). Jednotlivé projekty byly podpořeny granty AZV 15-28208A Určení příčin vzácných geneticky podmíněných nemocí pomocí metod analýzy genomu a zhodnocení přínosů tohoto přístupu pro klinicko-diagnostickou praxi; AZV15-27682A. Využití metod sekvenování nové generace pro časnou diagnostiku a individualizovanou léčbu dilatační kardiomyopatie a příbuzných forem kardiomyopatií; GAČR GA14-21903S Studium genetické architektury impulsivního násilného chování; GAČR GB14-36804G, Centrum mitochondriální biologie a patologie (MITOCENTRUM) a RVO 64165.
Čestné prohlášení
Autoři práce prohlašují, že v souvislosti s tématem, vznikem a publikací tohoto článku nejsou ve střetu zájmů a vznik článku nebyl podpořen žádnou farmaceutickou firmou.
Adresa pro korespondenci:
prof. Ing. Stanislav Kmoch, CSc.
Klinika dětského a dorostového lékařství 1. LF UK a VFN
Ke Karlovu 2, 121 00 Praha 2
Tel.: 224 967 691
e-mail: stanislav.kmoch@lf1.cuni.cz
Sources
1. Baird PA., Anderson TW, Newcombe HB et al. Genetic disorders in children and young adults: a population study. Am J Hum Genet 1988; 42: 677–693.
2. Blair DR, Lyttle CS, Mortensen JM et al. A nondegenerate code of deleterious variants in Mendelian loci contributes to complex disease risk. Cell 2013; 155: 70–80.
3. Pauling L, Itano, HA et al. Sickle cell anemia a molecular disease. Science 1949; 110: 543–548.
4. Ingram VM. A specific chemical difference between the globins of normal human and sickle-cell anaemia haemoglobin. Nature 1956; 178: 792–794.
5. Gitschier J, Wood WI, Goralka TM et al. Characterization of the human factor VIII gene. Nature 1984; 312: 326–330.
6. Botstein D, White RL, Skolnick M et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am J Hum Genet 1980; 32: 314–331.
7. Collins FS. Positional cloning moves from perditional to traditional. Nat Genet 1995; 9: 347–350.
8. Botstein D, Risch N. Discovering genotypes underlying human phenotypes: past successes for mendelian disease, future approaches for complex disease. Nat Genet 2003; 33 Suppl: 228–237.
9. Altshuler D. A haplotype map of the human genome. Nature 2005; 437: 1299–1320.
10. Auton A, Brooks LD, Durbin RM et al. A global reference for human genetic variation. Nature 2015; 526: 68–74.
11. Lek M, Karczewski KJ, Minikel EV et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature 2016; 536: 285–291.
12. Sobreira N, Schiettecatte F, Boehm C et al. New tools for Mendelian disease gene identification: PhenoDB variant analysis module; and GeneMatcher, a web-based tool for linking investigators with an interest in the same gene. Hum Mutat 2015; 36: 425–431.
13. Kirby A, Gnirke A, Jaffe DB et al. Mutations causing medullary cystic kidney disease type 1 lie in a large VNTR in MUC1 missed by massively parallel sequencing. Nat Genet 2013; 45: 299–303.
14. Kmoch S, Hartmannová H, Stiburková B et al. Human adenylosuccinate lyase (ADSL), cloning and characterization of full-length cDNA and its isoform, gene structure and molecular basis for ADSL deficiency in six patients. Hum Mol Genet 2000; 9: 1501–1513.
15. Kmoch S, Brynda J, Asfaw B et al. Link between a novel human gammaD-crystallin allele and a unique cataract phenotype explained by protein crystallography. Hum Mol Genet 2000; 9: 1779–1786.
16. Hřebíček M, Mrázová L, Seyrantepe V et al. Mutations in TMEM76* cause mucopolysaccharidosis IIIC (Sanfilippo C syndrome). Am J Hum Genet 2006; 79: 807–819.
17. Čížková A, Stránecký V, Mayr JA et al. TMEM70 mutations cause isolated ATP synthase deficiency and neonatal mitochondrial encephalocardiomyopathy. Nat Genet 2008; 40: 1288–1290.
18. Stiburková B, Majewski J, Šebesta I et al. Familial juvenile hyperuricemic nephropathy: localization of the gene on chromosome 16p11.2-and evidence for genetic heterogeneity. Am J Hum Genet 2000; 66: 1989–1994.
19. Živná M, Hulková H, Matignon M et al. Dominant renin gene mutations associated with early-onset hyperuricemia, anemia, and chronic kidney failure. Am J Hum Genet 2009; 85: 204–213.
20. Bolar NA, Golzio C, Živná M et al. Heterozygous loss-of-function SEC61A1 mutations cause autosomal-dominant tubulo-interstitial and glomerulocystic kidney disease with anemia. Am J Hum Genet 2016; 99:174–187.
21. Nosková L, Stránecký V, Hartmannová H et al. Mutations in DNAJC5, encoding cysteine-string protein alpha, cause autosomal-dominant adult-onset neuronal ceroid lipofuscinosis. Am J Hum Genet 2011; 89: 241–252.
22. Van de Steeg E, Stránecký V, Hartmannová H et al. Complete OATP1B1 and OATP1B3 deficiency causes human Rotor syndrome by interrupting conjugated bilirubin reuptake into the liver. J Clin Invest 2012; 122: 519–528.
23. Stránecký V, Hoischen A, Hartmannová H et al. Mutations in ANTXR1 cause GAPO syndrome. Am J Hum Genet 2013; 92: 792–799.
24. Hartmannová H, Kubánek M, Šrámko M et al. Isolated X-linked hypertrophic cardiomyopathy caused by a novel mutation of the four-and-a-half LIM domain 1 gene. Circ Cardiovasc Genet 2013; 6: 543–551.
25. Park EJ, Grabinska KA, Guan Z et al. Mutation of Nogo-B receptor, a subunit of cis-prenyltransferase, causes a congenital disorder of glycosylation. Cell Metab 2014; 20: 448–457.
26. Kmoch S, Majewski J, Ramamurthy V et al. Mutations in PNPLA6 are linked to photoreceptor degeneration and various forms of childhood blindness. Nat Commun 2015; 6: 5614.
27. Davidson AE, Lišková P, Evans CJ et al. Autosomal-dominant corneal endothelial dystrophies CHED1 and PPCD1 are allelic disorders caused by non-coding mutations in the promoter of OVOL2. Am J Hum Genet 2016; 98: 75–89.
28. Lišková P, Dudáková L, Evans CJ et al. Ectopic GRHL2 expression due to non-coding mutations promotes cell state transition and causes posterior polymorphous corneal dystrophy 4. Am J Hum Genet 2018; 102: 447–459.
29. Hartmannová H, Piherová L, Tauchmannová K et al. Acadian variant of Fanconi syndrome is caused by mitochondrial respiratory chain complex I deficiency due to a non-coding mutation in complex I assembly factor NDUFAF6. Hum Mol Genet 2016; 25: 4062–4079.
30. Gstrein T, Edwards A, Přistoupilová A et al. Mutations in Vps15 perturb neuronal migration in mice and are associated with neurodevelopmental disease in humans. Nat Neurosci 2018; 21: 207–217.
31. Lupski JR, Belmont JW, Boerwinkle E et al. Clan genomics and the complex architecture of human disease. Cell 2011; 147: 32–43.
Labels
Addictology Allergology and clinical immunology Angiology Audiology Clinical biochemistry Dermatology & STDs Paediatric gastroenterology Paediatric surgery Paediatric cardiology Paediatric neurology Paediatric ENT Paediatric psychiatry Paediatric rheumatology Diabetology Pharmacy Vascular surgery Pain management Dental HygienistArticle was published in
Journal of Czech Physicians
![Issue 3](https://www.prolekare.cz/media/cache/resolve/journal_issue/media/image_pdf/2acb4da2d6e911366dc61bb4a3ab5e7c.jpeg)
Most read in this issue
- Periodické horečky a jiná autoinflamatorní onemocnění
- Uzlinový syndrom u nemoci z kočičího škrábnutí dětí a dospělých
- Celiakie dětí a dospívajících
- Horizontální přenos genetické informace a jeho význam pro vznik antibiotické rezistence