Cirkulující nádorové buňky a prognóza karcinomu prostaty

Karcinom prostaty (KP) je nejčastější nádorové onemocnění u mužů. Prognóza pacientů s metastatickým onemocněním je nepříznivá, ačkoliv v tomto stadiu existují velké rozdíly v kvalitě života a době přežívání. Definice prognózy je nezbytná pro volbu léčebného postupu, který respektuje individuální riziko progrese onemocnění. Mezi základní prognostické parametry u metastatického onemocnění patří Gleasonovo skóre nádoru, hladina prostatického specifického antigenu (PSA), výkonnostní stav a další laboratorní markery. V posledních letech se v predikci odpovědi na protinádorovou léčbu uplatňuje detekce cirkulujících nádorových buněk (CTC), které jsou nezbytnou součástí metastatického procesu. Stanovení CTC využívá znalostí nádorově specifických antigenů na povrchu buněk. Jednotlivé metody stanovují CTC s různou citlivostí a zatím nejsou využitelné u lokalizovaného stadia KP. Pouze metoda imunomagnetické separace a semiautomatické vizualizace (CellSearch^TM) byla validována a schválena FDA pro použití v diagnostice a léčbě metastatického KP. Stanovení počtu CTC přímo koreluje s prognózou pacientů s kastračně rezistentním KP a je dynamičtějším markerem celkového přežití než hladina PSA. Změna v hodnotách CTC v průběhu léčby také výrazně zpřesňuje odhad rizika úmrtí. Nové postupy kultivace a genového profilování CTC mohou přispět k individualizaci léčby podobně jako u karcinomu prsu. Autoři předkládají přehledné informace o teorii, metodách detekce a klinickém využití CTC u kastračně rezistentního KP.

Klíčová slova:
karcinom prostaty – cirkulující nádorové buňky – prognostické parametry – biomarker

ÚVOD

Karcinom prostaty (KP) je nejčastějším nádorovým onemocněním u mužů a po karcinomu plic druhou nejčastější příčinou úmrtí z onkologických diagnóz (1). V rámci diagnostiky a sledování onemocnění se nejčastěji využívá stanovení hladiny prostatického specifického antigenu (PSA), vyšetření per rektum a v indikovaných případech také zobrazovací metody (počítačová tomografie, magnetická rezonance a scintigrafie). Podle dat z Národního onkologického registru dosáhla standardizovaná incidence KP v roce 2010 hodnoty 131/100 000 mužů, což představuje více než dvojnásobný nárůst za posledních 10 let. Zajímavý je fakt, že od počátku nového tisíciletí došlo k zastavení nárůstu mortality, která se nyní pohybuje kolem 28/100 000 mužů (obr. 1). Podle odhadů Institutu biostatiky a analýz Masarykovy univerzity v Brně bude v roce 2013 nově diagnostikováno s KP přibližně 8340 mužů, z toho více než 1000 (12,2 %) s primárně metastatickým postižením (2).

K posunu klinických stadií v posledních desetiletích došlo především na základě rozšíření PSA testování. Navzdory screeningu, rozvoji operačních metod a radioterapeutických protokolů dochází po radikální léčbě k relapsu onemocnění až u poloviny pacientů (3). Využití nových vyšetřovacích metod u KP sleduje několik cílů. V první řadě se jedná o zvýšení přesnosti PSA v předpovědi pozitivní biopsie prostaty. Další úroveň zahrnuje odhad patologické klasifikace po radikální prostatektomii (RP) a biochemického relapsu po radikální léčbě. Konečně nejvyšší zájem je věnován odhadu prognózy pacientů s primárně metastatickým KP nebo kastračně rezistentním KP (castration-resistant prostate cancer, CRPC). Jedním z nových biomarkerů, který je testován v řadě klinických studií, jsou cirkulující nádorové buňky (circulating tumor cells, CTC) v periferní krvi pacientů. Tento přehledový článek se věnuje teorii vzniku CTC, různým metodám detekce CTC a jejich klinickému využití.

TEORIE CIRKULUJÍCÍCH NÁDOROVÝCH BUNĚK

První dokumentovaná zmínka o nádorových buňkách v periferní krvi pochází z roku 1869, kdy australský lékař Thomas Ashworth vyslovil hypotézu, že buňky v krvi identické s buňkami primárního tumoru mohou souviset s metastatickým rozsevem u pacientů. Porovnal morfologii CTC u různých nádorů a uzavřel, že „pokud (CTC) pochází z existující nádorové masy, musely projít velkou částí oběhového systému, než dorazily do v. saphena zdravé končetiny“ (4). Patogeneze metastatického procesu zahrnuje několik kroků, které jsou ovlivněny jednak vlastnostmi nádorových buněk a jednak imunitní odpovědí organismu. V roce 1889 definoval anglický chirurg Stephen Paget interakci hostitel vs. nádorové buňky. Na základě pitevních výsledků více než 700 žen s metastatickým karcinomem prsu zpochybnil původní Virchowovu teorii embolizace částí nádorů, která měla být odpovědná za vznik metastáz. U pacientek totiž byly ve vyšší míře infiltrovány orgány, které mají relativně slabší krevní zásobení (skelet, vaječníky), zatímco například postižení sleziny bylo velmi vzácné. Paget tak přichází s teorií „seed and soil“ a přirovnal proces metastazování k rozsevu semen rostlin, který také probíhá všemi směry, ale nová rostlina vyroste pouze na příhodné půdě (5). V novém tisíciletí je tato teorie stále široce přijímána, ačkoliv termín „seed“ byl nahrazen progenitorovou nebo kmenovou buňkou a „soil“ je definováno jako stroma nebo orgánové mikroprostředí. V současnosti se uvažuje také o expresi tzv. „homing factors“ u CTC a v místě vzniku metastáz, které mohou předurčovat směrování CTC do jednotlivých metastatických lokací (6).

Po mnoha letech výzkumu je tak jisté, že proces metastazování je zahájen uvolněním subpopulace buněk primárního tumoru do krevního nebo lymfatického řečiště a migrací těchto buněk do tkání (obr. 2). Nádorové buňky podstupují změny známé jako epiteliálně mesenchymální transformace (EMT), umožňující přežití buněk blokováním apoptotického procesu a odpovědi na reakci imunitního systému (7). Koncept EMT vychází z in vitro studií, které zkoumaly embryonální vývoj, včetně změn fenotypu a chování buněk při invaginaci dovnitř embrya a tvorbě mesodermu. Pod vlivem různých růstových faktorů, cytokinů, proangiogenních a transkripčních látek dochází ke ztrátě vlastností epiteliálních buněk, tj. adhezivity a bazo-apikální polarizace. Na molekulární úrovni je nejdůležitějším krokem ztráta transmembránového glykoproteinu E-cadherinu. Současně buňka získává schopnost migrace přes bazální membránu a vstupu do krevního řečiště (8).

METODY DETEKCE CIRKULUJÍCÍCH NÁDOROVÝCH BUNĚK

Přítomnost CTC v periferní krvi je velmi vzácná, v současnosti se odhaduje v poměru jedna nádorová buňka na jednu miliardu dalších buněk s jádrem. Detekce CTC může být provedena několika různými metodami, které vždy začínají odběrem a zpracováním nesrážlivé periferní krve. Izolace CTC probíhá většinou pomocí imunomagnetické separace, která využívá vazby monoklonálních protilátek konjugovaných s ferromagnetickými částicemi na specifické antigeny na povrchu nádorových buněk. V magnetickém poli jsou tyto buňky poté odděleny od ostatních krevních elementů. Po této fázi se jednotlivé metody rozcházejí. Existuje velké množství různých postupů, které jsou shrnuty v tabulce 1. Největšího rozšíření doznala a povolení amerického úřadu Food and Drug Administration (FDA) získala metoda CellSearch^TM společnosti Veridex LLC. Esej obohacuje CTC na základě vazby protilátky proti EpCAM (epithelial cell adhesion molecule) konjugované k magnetické kuličce. Buňky jsou dále klasifikovány jako CTC pomocí barvení cytokeratinu (CK-6, 8 a 18), zobrazení jádra diamidinofenylindolem (DAPI) a vyloučení leukocytů (barvení CD45). Buňky jsou v magnetické kazetě rozvrstveny, aby nedocházelo k jejich překrývání. Automatický systém CellTracks Analyzer^® poté provede sken kazety, identifikuje možné nádorové buňky a obrázky nabídne laboratornímu technikovi (event. patologovi) ke konečné revizi na základě přísných morfologických kritérií. Výsledek je poskytnut jako počet CTC v 7,5 ml plné krve. Buňky u pacientů s CRPC detekované touto metodou mají řadu charakteristických znaků, jedná se hlavně o expresi PSA, alfa-metylacyl-CoA racemázy (AMACR) a další specifické genomické abnormality, především nárůst kopií genů pro androgenní receptor, deleci PTEN a fúzi TMPRSS2. Úskalím metody je fakt, že buňky zobrazené v kazetě představují pouze asi 1–10 % všech CTC (9). CellSearch^TM totiž nedokáže identifikovat buněčné fragmenty ani bezjaderné nebo nekrotické buňky. Některé CTC navíc neexprimují EpCAM molekulu, a nejsou tak vychytávány. Významným problémem může být chyba v hodnocení, neboť ve sporných případech je označení CTC závislé na úsudku operátora (obr. 3). V současnosti se nicméně jedná o nejčastěji používanou metodu, která se díky své relativní jednoduchosti a semiautomatickému postupu stala rutinní součástí řady klinických studií u pacientů s CRPC.

KLINICKÉ VYUŽITÍ CIRKULUJÍCÍCH NÁDOROVÝCH BUNĚK

Prognostické parametry pozitivní biopsie prostaty nebo výsledků radikální léčby byly v minulosti velmi dobře popsány a matematické modely jsou neustále zpřesňovány novými biomarkery nebo využitím zobrazovacích metod. V současnosti ale existuje velmi málo dat o prognóze pacientů s metastatickým nebo kastračně rezistentním KP. Mezi klasické parametry patří nepříznivé Gleasonovo skóre, vysoké hladiny PSA před zahájením léčby nebo rychlý čas zdvojení PSA (PSA doubling time). Patrně nejznámější nomogram připojuje ještě hladinu LDH, ALP a hemoglobinu, přítomnost viscerálních metastáz a špatný klinický stav pacientů. Na základě těchto dat je možné pacienty s CRPC rozdělit do několika rizikových skupin s velmi rozdílnou dobou celkového přežití (medián 8,8–22,8 měsíců) (10). Detekce CTC u pacientů s metastatickým nádorovým onemocněním může přispět ke zpřesnění jejich prognózy, nicméně klinické využití CTC je zatím pouze na teoretické úrovni.

Metoda CellSearch^TM byla testována u pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem, karcinomem prostaty a u pacientek s karcinomem prsu ve třech multicentrických studiích, které byly publikovány souhrnně v roce 2010 (11). Na základě absolutního počtu CTC v 7,5 ml periferní krve jsou stanoveny dvě skupiny s rozdílnou prognózou (nepříznivá vs. příznivá). V případě CRPC a karcinomu prsu se za nepříznivý počet považuje pět a více CTC, u kolorektálního karcinomu se jedná o tři a více CTC. Vyšší počet CTC byl prokázán u pacientů s kostními a viscerálními metastázami proti samotnému uzlinovému postižení. Počet CTC před zahájením chemoterapie také jasně koreluje s prognózou pacientů (obr. 4). Celkem 231 pacientů s CRPC bylo hodnoceno před podáním chemoterapie a každý měsíc v průběhu léčby (12). U pacientů s pěti a více CTC byla střední doba přežití kratší než u pacientů s nižším počtem (11,5 vs. 21,7 měsíců). Počet CTC také dobře koreloval s prognózou ve všech následujících odběrech. Nejlepší prognózu pak měli pacienti s příznivou hodnotou CTC ve všech odběrech (přežití > 26 měsíců). Zajímavý je fakt, že změna z původně nepříznivého na příznivý počet CTC znamená prognózu prakticky srovnatelnou s předchozí skupinou (přežití 21,3 měsíců). Předpokládá se, že monitorování CTC v průběhu nákladné a rizikové chemoterapie pomůže identifikovat ty pacienty, pro které nemá tato léčba žádný přínos. V současnosti se k monitoraci pacientů s CRPC využívá hlavně změn hladiny PSA, biochemická odpověď je definována jako pokles PSA nejméně o 30 % původní hodnoty (3). Autoři předchozí studie zhodnotili nejen prediktivní význam poklesu CTC, ale porovnali jej i s poklesem PSA. Výhodou CTC je schopnost jasně definovat prognózu již po prvním měsíci léčby, zatímco PSA je informativní až po 3 měsících. Praktické využití těchto výsledků je ale stále nejasné.

Hodnocení CTC bylo také využito v odhadu prognózy po radikální prostatektomii. V této oblasti bylo ale zatím provedeno velmi málo studií s nedostatečným počtem pa-cientů. Problém je také v detekci CTC metodou CellSearch^TM, protože pozitivní nález je zjištěn u relativně malého procenta pacientů (cca 20 % případů). V jedné studii navíc nebyl rozdíl v detekci CTC mezi skupinou s KP a kontrolní skupinou s negativní biopsií prostaty (p = 0,946) a navíc nebyla prokázána korelace CTC s žádným klasickým prediktivním parametrem (13). Jako slibnější se jeví metoda RT-PCR, která dokáže detekovat transkripční produkty specifických genů v periferní krvi již od velmi malého množství. Touto metodou byla také prokázána korelace nálezů s patologickou klasifikací, Gleasonovým skóre, postižením lymfatických uzlin a pravděpodobně i s prognózou pacientů s biochemickým relapsem po radikálním výkonu (14, 15).

VLASTNÍ KLINICKÉ ZKUŠENOSTI

V roce 2011 jsme zahájili grantový projekt se zaměřením na detekci CTC a sledování exprese genů u CRPC jako součást individualizace systémové léčby. V rámci projektu testujeme novou metodu detekce CTC Adnatest Prostate Cancer Select/Detect (Adnagen, Německo). Pro potřeby analýzy odebíráme 5 ml periferní krve, ze které jsou nádorové buňky izolovány pomocí imunomagnetické separace obdobně jako u metody CellSearch^TM (obr. 5A). Výsledná frakce je poté lyzována a pomocí magnetických oligo(dT)25-partikulí je izolována mRNA nádorových buněk. Následně je syntetizována cDNA, která je použita jako matrice pro detekci CTC pomocí multiplex-PCR. Je hodnocena amplifikace tumor asociovaných genů (PSMA, PSA, EGFR) a kontrolního genu aktinu. Test na přítomnost CTC je pozitivní, je-li jasně detekován PCR fragment alespoň jednoho tumor asociovaného transkriptu v koncentraci vyšší než 0,30 ng/µl (obr. 5B). Část obohacené leukocytární a CTC frakce získaná gradientovou centrifugací je použita pro výzkum metody kultivace CTC v prostředí různých růstových faktorů (obr. 5C) (16). V rámci projektu probíhá také profilování genové exprese buněk primárního nádoru (z histologických preparátů) a detekovaných CTC. Kritéria pro zařazení do protokolu jsou kastrační hladina testosteronu (< 1,75 nmol/l), vzestup PSA třikrát za sebou s konečnou hladinou PSA > 2 ng/ml, progrese PSA při vysazení antiandrogenů nebo při sekundární hormonální manipulaci a generalizace. U pacientů s CRPC před zahájením chemoterapie odebíráme žilní krev a stanovujeme hladinu transkriptů tumor specifických markerů CTC. Kontrolní odběr probíhá po 3.–4. cyklu chemoterapie.

Metoda Adnatest byla zatím ověřena v souborech pacientek s metastatickým karcinomem prsu, v současnosti se také testuje detekce CTC u pacientů s pokročilým kolorektálním karcinomem. U tohoto onemocnění je hodnocena amplifikace tumor asociovaných genů GA733-2 (EpCAM), karcinoembryonálního antigenu (CEA) a EGFR. V jedné prospektivní studii českých autorů bylo zařazeno celkem 14 pacientů s jaterními metastázami indikovaných k chirurgickému řešení. Deset pacientů podstoupilo před výkonem chemoterapii. Odběr krve na CTC byl prováděn předoperačně, ve chvíli mobilizace jater během výkonu, těsně po výkonu a 2. a 7. pooperační den. Pouze u třech pacientů byly detekovány CTC, z toho u jednoho ve všech odběrech, u jednoho pouze v průběhu výkonu a u jednoho pouze předoperačně. Na tomto malém souboru autoři ukázali pouze ojedinělý záchyt CTC u pacientů s kolorektálním karcinomem, příčinou mohlo být podání chemoterapie před prvním odběrem u většiny případů nebo relativně malý rozsah onemocnění (17).

Zatím největší prospektivní multicentrická studie zaměřená na detekci CTC metodou AdnaTest u metastatického karcinomu prsu proběhla v Německu. Celkem 254 pacientek bylo zařazeno do protokolu DETECT, odběr periferní krve proběhl před zahájením jakékoliv léčby. V rámci této studie byl porovnán prognostický význam metod CellSearch^TM a AdnaTest Breast Cancer Select/Detect. Tato metoda využívá amplifikace genů HER2, MUC1 a GA733-2. Celkem 116, resp. 88 z 221 (50 %, resp. 40 %) vzorků bylo hodnoceno jako CTC pozitivní při stanovení metodou CellSearch^TM, resp. AdnaTest Breast Cancer. Pozitivita CTC při hodnocení metodou CellSearch^TM byla nepříznivým nezávislým prediktorem celkového přežití (18,1 vs. 22,7; p < 0,001). Metoda AdnaTest Breast Cancer neprokázala statisticky významnou prediktivní schopnost ve vztahu k celkovému přežití (p = 0,278) (18).

Výhody této metody spočívají v rozpoznání jednotlivých tumor asociovaným markerů, a tím umožňují větší flexibilitu v konstrukci dalších testů pro detekci jiných nádorových buněk. Pomocí této metody je také možné detekovat kmenové buňky a markery EMT. Izolovaná mRNA může být dále použita pro stanovení profilu genové exprese CTC. Proces výběru CTC a následného stanovení tumor asociovaných genů může být prováděn odděleně. Metoda je relativně levná a není zatížena chybou v hodnocení, neboť výsledek je stanoven plně automatizovaným procesem. Mezi nevýhody patří nemožnost určit absolutní počet nádorových buněk a problém eventuální falešné pozitivity při expresi markerů nenádorovými buňkami. Hodnocení koncentrace fragmentů genů přináší možná méně informací než zjištění absolutního počtu CTC. Bohužel nevíme, zda získaný signál pochází z několika málo buněk, které ale silně transkribují dané geny, či z mnoha buněk, které je transkribují slabě, nebo z kombinace obou možností (19).

ZÁVĚR

Hodnocení prognózy u pacientů s KP je zcela zásadní pro správnou volbu diagnostických a léčebných postupů. Prognostické parametry lokalizovaného nádoru, pro který je první volbou radikální léčba, jsou dobře definovány, zatímco u pacientů s metastatickým onemocněním relevantní data chybí. Většina prognostických modelů u CRPC byla vytvořena na základě retrospektivních studií, které nereflektují rychlé změny ve výzkumu systémové léčby. Hodnocení CTC může pomoci určit prognózu pacientů s metastatickým KP během léčby rychleji než změny hladiny PSA nebo dalších biomarkerů. Předpokládá se, že CTC doplní PSA jako tzv. zástupný marker celkového nebo nádorově specifického přežití. Určení genového profilu CTC by mohlo přispět k další individualizaci léčby, včetně volby méně agresivních režimů u pacientů s nepříznivou prognózou.

Zkratky

ALP alkalická fosfatáza

AMACR alfa-metylacyl-CoA racemáza

cDNA komplementární deoxyribonukleová kyselina

CRPC kastračně rezistentní karcinom prostaty (castration-resistant prostate cancer)

CTC cirkulující nádorové buňky (circulating tumor cells)

DAPI 4’,6-diamidino-2-fenylindol

EGFR epidermal growth factor receptor

EMT epiteliálně mezenchymální transformace

EpCAM epithelial cell adhesion molecule

FACS fluorescence-activated cell sorting

FDA Food and Drug Administration

IMS imunomagnetická separace

KP karcinom prostaty

LDH laktátdehydrogenáza

mRNA messenger ribonukleová kyselina

PSA prostatický specifický antigen

PSMA prostatický specifický membránový antigen

PTEN phosphatase and tensin homolog

RARE RosetteSep-Applied Imaging Rare Event

RP radikální prostatektomie

RT-PCR reverse transcription-polymerase chain reaction

TMPRSS2 transmembrane protease, serine 2

Práce byla podpořena grantem IGA MZ ČR č. NT/12205-5.

ADRESA PRO KORESPONDENCI:

MUDr. Otakar Čapoun, FEBU

Urologická klinika 1. LF UK a VFN

Ke Karlovu 8, 128 08 Praha 2

e-mail: otakar.capoun@seznam.cz