Úloha kouření v epigenetické modifikaci fenotypu: nejnovější poznatky o patologických procesech vyvolaných kouřením

Mnoho faktorů životního prostředí, včetně chemických látek v cigaretovém kouři, má škodlivé účinky na lidské zdraví. Epidemiologické studie opakovaně potvrdily, že prenatálně exponované plody kouřících matek jsou ohroženy nejen komplikacemi průběhu těhotenství, ale i zpomalením růstu a narušením vývoje plodu. Také se zvyšuje riziko závažných onemocnění manifestujících se v dětství a v dospělosti. Předpokládaným patologickým procesem vedoucím ke změně fetálního programování jsou interakce genů a environmentálních faktorů prostřednictvím epigenetických mechanismů. Ačkoliv tyto vědecké problémy teprve začínáme studovat, byly už popsány některé modely epigenetického ovlivňování regulace: metylace DNA, genová regulace zprostředkovaná nekódujícími RNA (ncRNA) a modifikace histonů. Naše současné znalosti potvrzují, že jak aktivní kouření, tak i expozice cigaretovému kouři in utero mohou indukovat změny ve všech studovaných epigenetických procesech a že mohou být dokonce přeneseny na další generaci prostřednictvím linie mužských zárodečných buněk.

Klíčová slova:
geny – kouření – epigenetické mechanismy – fetální programování

EPIGENETIKA

Epigenetika je relativně mladý, ale dynamicky se rozvíjející vědní obor. Každoročně jsou publikovány stovky článků, zakládány nové specificky zaměřené časopisy, organizovány desítky odborných konferencí a vědeckých setkání zaměřených na tuto problematiku (1).

Předmět zájmu je široký, zabývá se studiem mechanismů mitotických nebo meiotických změn, které nemohou být vysvětleny modifikací sekvencí DNA. Významným obdobím pro působení epigenetických vlivů je prenatální vývoj. Genom obsahuje informace nutné pro produkci všech typů buněk a specifikaci jejich funkcí. Embryonální buňky jsou velmi plastické, což souvisí s vysokou dynamikou obměny bílkovin jejich chromatinu. Výsledkem je flexibilita a přizpůsobivost genové expresi, která může být měněna zevními epigenetickými faktory a mění či zachovává identitu embryonálních buněk. Poznávání epigenetických procesů se například využívá pro vysvětlení různého výskytu nemocí u jednovaječných, tedy geneticky identických dvojčat (2).

Epigenetické mechanismy jsou esenciální pro normální vývoj a diferenciaci, ale mohou být také modifikovány, což se následně manifestuje vrozenými vývojovými vadami a zvýšením rizika nejrůznějších onemocnění (rakoviny, kardiovaskulárních nemocí, diabetes mellitus, obezity, narušení reprodukčních schopností mužů a jiných). Kromě poznání vlastních epigenetických procesů jsou předmětem zájmu i faktory, které jejich modifikaci vyvolávají. Proto se vyčleňuje podobor environmenální epigenetika, který kombinuje tradiční epigenetické metody se studiem zevních modifikujících faktorů (3). Expozice jedinců i celých populací zevním faktorům se liší frekvencí, mírou a načasováním, což jak výzkum, tak i převedení jeho závěrů do praxe do jisté míry komplikuje (4).

Přibývá důkazů, že modifikace epigenetických procesů, které probíhají zejména v období časného prenatálního vývoje, se mohou přenášet i na další generace (4, 5). V popředí zájmu dalších specialistů jsou proto i epigenetické procesy v placentě, jejíž správný vývoj a funkce jsou klíčové pro zdraví, růst a přežití plodu. Placenta umožňuje výměnu látek mezi matkou a plodem, částečně chrání plod před průnikem chemických škodlivin z matčina krevního oběhu. Vykazuje určitou metabolickou, hormonální a imunitní aktivitu. Nicméně placentární bariéra není stoprocentní, řada xenobiotik placentou prochází, nebo se v ní zadržuje a kumuluje, mění její morfologické a funkční vlastnosti i genovou expresi (6).

Podle tzv. „Bakerovy hypotézy“ se prostředí, kterému je plod vystaven během intrauterinního vývoje, může podílet nejen na jeho prenatálním vývoji, ale také se uplatňuje v etiologii chronických chorob v dospělém věku. Ve fetálním období může působit na plod mnoho zevních faktorů jako výživa, léky, stres, trauma apod (3). Ve vyspělých zemích je nejčastější příčinou zhoršených podmínek při vývoji plodu kouření matek. Epidemiologické souvislosti prenatální expozice kouření byly potvrzeny především ve vztahu k vyššímu riziku kardiovaskulárních nemocí a diabetu 2. typu (7), chronické obstrukční nemoci plicní (8), predispozice k astmatu (9), k poruchám reprodukce (10), zhoubnému bujení (11) a různým neurobehaviorálním odchylkám či onemocněním (12). S těmito negativními následky se setkáme nejen v dětském věku, ale i v dospělosti. Matčino kouření během těhotenství tak může ovlivnit zdraví jedince po celý jeho život. Vzhledem k šířící se pandemii kouření je tedy toto chování celosvětově nejen závažným zdravotním problémem, ale i ekonomickou zátěží (13).

Pro kauzalitu nalezených souvislostí mezi prenatální expozicí kouření a poruchami vývoje plodu i vyšším rizikem nemocí po narození a v dospělosti svědčí mnoho biologicky plausibilních mechanismů. Četné toxické, mutagenní a karcinogenní chemické látky z cigaretového kouře, včetně nikotinu, procházejí placentou, nebo se v ní kumulují a narušují její funkce i strukturu. Mnohé z komponent cigaretového kouře přispívají ke zvýšení oxidačního stresu (14) a ke genetické nestabilitě (15). Protože mechanismy metabolismu xeno-biotik jsou u plodu nezralé, probíhají tyto procesy pomaleji, a proto chemické látky ve fetálním organismu perzistují déle; běžně bývají koncentrace v pupečníkové krvi či tkáních vyšší než v séru nebo tkáních matek (14). Buňky plodu ve vývoji či v procesu dělení jsou rovněž k účinkům cizorodých látek více vnímavé.

Za hlavní příčinu intrauterinní růstové retardace, kterou v důsledku prenatální expozice kouření nejčastěji pozorujeme, se obecně pokládají: dlouhodobá hypoxie a hyponutrice v důsledku vazokonstrikčního působení nikotinu (16), zvýšené hladiny karbonylhemoglobinu (17), zbytnění placentální membrány (18) a poruchy vývoje trofoblastu (19). Právě zjištění, že se intrauterinní růstová retardace asociuje s řadou nemocí a poruch po narození i v dospělosti, iniciovala studium dalších mechanismů, kterými by bylo možné vysvětlit předpokládanou přímou kauzální souvislost (20).

Kromě mutagenních genotoxických pochodů ovlivňují mnohé zevní faktory expresi genů cestou epigenetických příhod (21). Protože se fenotyp každého jedince formuje v průběhu intrauterinního života, je logické, že škodliviny přecházející z těla matky mohou iniciovat epigenetické změny v expresi různých genů, a tímto způsobem následně determinovat predispozicí k různým nemocem v dětství i dospělosti (22). Epigenetické programování zasahuje jak zárodečné pohlavní buňky, tak somatické buňky vyvíjejícího se embrya (23). Nejkritičtějším obdobím je prvních 8–9 týdnů po oplodnění, kdy končí organogeneze a mohou se zde uplatňovat i vlivy z pre- a perikoncepčního období.

Dosavadní studium epigenetického ovlivňování genových regulací se zaměřuje především na metylace DNA a regulační aktivitu nekódujících RNA (ncRNA) (24). Byly však už také definovány některé další epigenetické regulátory (hydroxymetylace DNA, modifikace histonů – bílkovinných součástí jádra). Prostřednictvím změn na úrovni ncRNA a histonů se jimi iniciované změny fenotypů mohou přenést i na další generace (25).

METYLACE DNA

Působení chemických faktorů na molekulární úrovni prostřednictvím epigenetických mechanismů bylo zatím nejlépe prostudováno u metylace DNA, která je pokládána za esenciální pro genovou expresi. Metylace DNA vzniká na podkladě kovalentní vazby metylové skupiny na 5. pozici cytosin/guaninového prstence (CpG), při kterém vznikne 5-metylcytosin. V normálních buňkách nejsou obvykle oblasti CpG metylovány. Aberantní metylace DNK se mohou projevit jako hypo- i jako hypermetylace. Každá tato forma může vyvolat chromozomální instabilitu, potlačení transkripčních genů, změny struktury chromatinu, inaktivaci chromozomu X aj., s následnou závažnou modulací fenotypu, ale i úmrtím embrya (26). V pozdějším životě se zvyšuje riziko nádorového bujení i dalších onemocnění (27). Metylace DNA se uskutečňuje podle předloh specifických pro různé tkáně, v průběhu života se její úroveň snižuje (28).

Během embryonálního vývoje metylace DNA probíhá v somatických i zárodečných buňkách, v menší míře i v extraembryonálních tkáních. Pro přežití a zdravý vývoj organismu je zásadní podmínkou, aby tyto aberantní metylace byly opraveny ještě v prenatálním období, které představuje kritické „okno“ zvýšené vnímavosti k působení rizikových faktorů (6).

Na rozdíl od experimentálních zvířat jsou pro studium následných vlivů změn metylace na plod u lidí využitelné v podstatě pouze placenta a pupečníková krev (29). Metylaci DNA mohou ovlivnit četné faktory, mezi jinými i jednotlivé složky v cigaretovém kouři, např. polycyklické aromatické uhlovodíky (30), arsen (31), kadmium (32). Všem těmto látkám jsou kuřáci exponováni podstatně více než běžná nekouřící populace. U dospělých osob se opakovaně zjistilo, že kouření je asociováno s výskytem aberantních specifických dinukleotidových metylací CpG na DNA. Ty mají zásadní úlohu v regulaci genové exprese a jejich přítomnost ve tkáni či tělní tekutině je spojena s hypometylací DNA. V placentě kuřaček byly nalezeny přesvědčivé korelace mezi hypometylací DNA a výskytem CpG u většiny studovaných genů (u 438 ze 623), zatímco u nekuřaček korelovaly tyto markery pouze u 25 genů. Pro působení epigenetických vlivů i na plod svědčí to, že podobné snížení metylace DNA bylo popsáno i v pupečníkové krvi novorozenců narozených matkám kouřících aktivně i pasivně (26). Změny metylace DNA iniciované prenatální expozicí matčinu kouření přetrvávají nadále v dětském a dospívajícím věku (33).

Výsledky těchto studií tedy svědčí pro kauzální etiologickou účast kouření. Pokud jsou těmto xenobiotikům exponovány pohlavní buňky rodičovského páru v době oplodnění, dochází v nich k dynamické demetylaci DNA a k transgeneračnímu přenosu změněného fenotypu (34). Podle současných znalostí můžeme tedy konstatovat, že všechny dosavadní studie zatím jednoznačně potvrzují souvislosti mezi prenatální expozicí kouření a poruchami metylace DNA. Další výzkum by měl odhalit kritická „okna“ vysoké vnímavosti k působení xenobiotik i podrobnější mechanismy jejich působení.

NEKÓDUJÍCÍ RNA (ncRNA)

Na eukaryotické transkripci se podílí velký počet RNA kódujících proteiny, ale i RNA s malým nebo nulovým kódujícím potenciálem. Novější studie se zaměřily na možnou úlohu RNA v epigenetickém programování; naznačují, že RNA není jen produktem transkripce DNA, ovlivňující složení a produkci proteinů, ale že nekódující RNA (ncRNA) mají i určitou schopnost vlastní regulační aktivity. V současné době jsou studovány 3 formy ncRNA: mikro-RNA (miRNA), piRNA (reagující s Piwi proteiny) a dlouhé (long ncRNA) (4, 35). V centru efektorových komplexů obsahujících mikro- a Piwi RNA jsou proteiny Argonaute. Skládají se z centrální oblasti obsahující komplex PAZ (podle proteinů PIWI, Argonaute a Zwille – váže se na 3´ článek vlákna RNA a má specifickou úlohu u miRNA) a uhlíkový terminál PIWI, s nímž jsou v interakci piRNA (36).

miRNA byly popsány v roce 1993 a při dalším výzkumu se ukázalo, že jsou klíčovými regulátory vývoje. Ovlivňují genovou expresi prostřednictvím vazeb komplementárních k bázím cílové mRNA a mohou způsobit buď degradaci mRNA, nebo zabránit její transkripci.

Zralé formy miRNA obsahují kolem 22 nukleotidů, mají vlásenkovitou strukturu a byly nalezeny nejen u mnoha živočišných druhů (kromě savců i u červů a much), ale i u rostlin a virů. Byla popsána jejich regulační úloha v různých biologických procesech, zahrnujících diferenciaci, proliferaci, apoptózu, reakci na stres (24). Genovou expresi ovlivňují cestou potlačení transkripce, degradací mRNA nebo modifikací chromatinu (22). U člověka bylo identifikováno přes 700 miRNA, předpokládá se však, že jich je ve skutečnosti více než 1000 (37). Tkáňově specifické miRNA jsou v srdeční tkáni, placentě, rakovinových buňkách různých zhoubných nádorů. Byly popsány jejich anti-apoptické, onkogenetické a tumorsupresivní vlastnosti. Předpokládá se, že výsledky základních výzkumů budou využitelné při diagnostice i léčbě nemocí srdce a rakoviny. Mají klíčovou úlohu i při diferenciaci a regulaci zánětlivých buněk. Mohly by být využívány jako biomarkery pro časnou detekci nemocí souvisejících s molekulárními a genetickými změnami (38). Mezi environmentálními faktory, které změny v miRNA vyvolávají, je nejčastěji studován vliv kouření.

Expozice buněk normální a rakovinové plicní tkáně kondenzátu cigaretového kouře vyvolala v obou kulturách zvýšení miR-31 (podtypu mikro-RNA) provázené v tumorogenní tkáni výrazným zvýšením proliferace nádorových buněk. Je možné, že tímto mechanismem se kouření uplatňuje v promoci plicního karcinomu (39). Jiní autoři našli v bronchiálních epiteliálních buňkách kuřáků sníženou expresi u 28 podskupin miRNA v porovnání s nekuřáky; nejvýraznější bylo snížení exprese miR-218. I tato práce naznačuje možný mechanismus, kterým se kouření uplatňuje v etiologii respiračních nemocí (40). Signifikantně vyšší výskyt aberantních miRNA v tkáních plic a jater byl zjištěn u experimentálních potkanů exponovaných tzv. pasivnímu kouření. Vnímavost buněk obou orgánů na cigaretový kouř vyjádřená expresí miRNA však byla ovlivněna předcházející expozicí jiným chemickým látkám (včetně různých chemopreventivních substancí jako N-acetylcystein, indol-3-carbiol, 5-6-benzo-flavon, fenetyl-isocyanát): v plicích se vnímavost k indukci aberantních miRNA snížila, v játrech naopak výrazně zvýšila (4). Práce podněcuje k dalším studiím, jejichž výsledky by byly v praxi použitelné pro prevenci i terapii. AberantnímiRNA (miR-16, miR-21 a miR-146a) byly nalezeny v buněčných kulturách z lidské placenty po expozici nikotinu a benzo-a-pyrenu. Autoři své výsledky interpretují jako vysvětlení mechanismu horší funkce placenty u kuřaček, která přispívá k následné intrauterinní růstové retardací (6, 41).

V lidských spermiích bylo identifikováno více než 100 druhů miRNA; exprese až pětiny z nich byla významně odlišná u kuřáků ve srovnání s nekuřáky. Čtyři změněné miRNA byly opakovaně nacházeny v testes, seminální plazmě a spermiích neplodných mužů (např. 10). Autoři těchto studií předpokládají, že tyto změněné miRNA se účastní procesů buněčné proliferace, diferenciace a zániku a změn apoptózy. Pokud spermie obsahující změněné miRNA oplodní vajíčko, přenesou změnu fenotypu i do další, přímo neexponované generace, což už bylo experimentálně prokázáno na myších (42). Změněné miRNA mohou také působit nepřímo, a to prostřednictvím iniciace změn v metylaci DNA a/nebo modifikaci histonů (10). Poruchy reprodukce u mužských potomků kuřáků patří mezi nejčastější klinické projevy změny fenotypu miRNA indukované kouřením (34, 43, 44).

Třídy piRNA a PIWI proteinů byly objeveny v roce 2006 a studovány u much (Drosophila melanogaster), ryb a v ovariích a testes savců (myší). Studium tvorby piRNA i faktorů, které je mohou modifikovat, je teprve v začátcích, ale otevírá novou dimenzi poznání o genové regulaci. piRNA obsahují 24–30 nukleotidů a jsou pokládány za esenciální podmínku při zabezpečení mnoha klíčových procesů u vývojové linie pohlavních buněk v embryonálním období savců a následně i při spermiogenezi, aktivaci oocytů a fertilitě u dospělých jedinců (45). PIWI proteiny se vyskytují jak v cytoplazmě, tak v jádrech zárodečných buněk. Mezi obratlovci mají piRNA odlišnou a jedinečnou úlohu u samčích zárodečných buněčných linií, protože tyto buňky průběžně procházejí mitózami a meiózami v dospělosti a během vývoje od spermatid k pohyblivým spermiích prodělávají velké změny (45).

Hlavní funkcí piRNA je potlačení stále se přepisujících genomových „parazitů“ v zárodečných buňkách; tyto elementy se mohou přemisťovat do jiných oblastí genomu, a tím poškozovat geny. V experimentech na myších již bylo prokázáno, že deficit piRNA vyvolává závažná poškození gametogeneze. piRNA také ovlivňují metylaci DNA, zbývá odhalit, jakým mechanismem (46). Piwi proteiny byly lokalizovány i v somatických buňkách, a tak není vyloučeno, že piRNA mají vliv na širší spektrum biologických procesů (45). Dosud nevíme, které faktory tvorbu nebo změny piRNA vyvolávají.

Dlouhé nekódující RNA (lnc RNA) obsahují 100–100 000 bází. Řada studií dokumentuje, že jsou specifické pro různé živočišné druhy (dosud byly identifikovány u více než 60 druhů) i pro buňky různých tkání stejného druhu. U mnohých ještě neznáme jejich funkci, u jiných byly popsány kontrolní zásahy v procesu impritingu. Výzkum je teprve v začátcích, ale víme, že souvisejí se vznikem řady nemocí: zvyšují riziko některých zhoubných nádorů, Alzheimerovy choroby, koronární nemoci srdeční, diabetu 2. typu, virových infekcí (35).

Nejvíc poznatků je zatím o long ncRNA nazvané Xist; má zřejmě klíčovou roli v inaktivaci chromozomu X (Xi) v samičí placentě savců, aby byla zachována aktivita pouze jednoho chromozomu X. Nachází se pouze u placentárních savců. Chromatin v inaktivovaném Xi se chová dynamicky; chromozom X se opakovaně inaktivuje a reaktivuje v buněčné mase blastocytu, který se vyvine v embryo, zatímco v buňkách somatických je stabilní. Embryonální buňky mají při své diferenciaci značný programovací potenciál, a studium funkce Xist proto umožňuje vyšetřovat epigenetickou souvislost vývoje různých buněk, např. v hematopoetickém systému nebo v maligních tkáních (2).

Další výzkum směřuje k objasnění případných účastí long ncRNA v karcinogenezi a jejich ovlivnění environmentálními faktory. Dosavadní poznatky nasvědčují, že ke zvýšení exprese lnc RNA dochází po expozici tkání karcinogennímu nitrosaminu NNK (vyskytuje se specificky v tabáku a vzniká také při metabolismu nikotinu) a že se častěji a ve větším počtu vyskytují ve zhoubných nádorech plic a prsu (47).

Přestože naše znalosti o účincích cigaretového kouření na expresi a funkci ncRNA jsou teprve v začátcích, první výsledky svědčí o tom, že tyto epigenetické mechanismy mohou ovlivňovat nejen fetální vývoj, ale i výskyt onemocnění a poruch v pozdějším věku cestou přeprogramování fyziologických funkcí na buněčné úrovni. Dosavadní poznatky nastolují otázky pro zkoumání mezigeneračního přenosu změn ncRNA způsobených vlivem cigaretového kouře na zárodečné buňky (4).

MODIFIKACE HISTONOVÝCH PROTEINŮ

Každý histon je složen ze strukturované části a nestrukturované „vlečky“ složené z aminokyselin. Kovalentní modifikace na této koncové části se uskutečňuje např. acetylací, metylací, fosforylací aj. Modifikace histonů katalyzují četné enzymální metyltransferázy, acetyltransferázy, deacetylázy. Různé kombinace těchto modifikací mohou nepříznivě ovlivňovat metylaci DNA, reparace genotoxických poškození, genovou expresi, inaktivaci chromozomu X, případně aktivovat doposud „mlčící“ faktory (48). Klinicky se tyto změny mohou projevit zvýšeným výskytem mnoha onemocnění, a proto i v této oblasti pokračuje intenzivní výzkum. Modifikace histonů v placentě ovlivňuje růst a diferenciaci placenty a toleranci v jednotce matka–plod. (6). V experimentech byly prokázány souvislosti modifikace histonů vyvolané cigaretovým kouřem s intrauterinní růstovou retardací, diabetem, jaterními změnami i markery kardiovaskulárního rizika (22).

ZÁVĚR

Aktuální poznatky o epigenetických mechanismech, kterými zevní faktory mohou působit na utváření vrozeného genotypu, přinášejí důležité informace o kauzálních příčinách četných onemocnění, která se manifestují v dospělém věku. Mnohé z nich jsou iniciovány během intrauterinního života, nebo dokonce přenášeny prostřednictvím zárodečných buněk na další, dosud přímo neexponovanou generaci. Publikované výsledky potvrzují, že ve většině prostudovaných epigenetických procesů se uplatňuje kouření.

Zkratky

CpG - cytosin/guanin
long ncRNA - dlouhé RNA
miRNA - mikro-RNA
ncRNA - nekódujících RNA
piRNA - mikro-RNA reagující s Piwi proteiny

Adresa pro korespondenci:

prof. MUDr. Drahoslava Hrubá, CSc.

Ústav preventivního lékařství LF MU

Kamenice 5, 625 00 Brno

e-mail: hruba@med.muni.cz