Testování DHPLC analýzy pro detekci mutací u hemofilie A

Overview

Východisko.
Hemofilie A je jednou z nejčastějších vrozených krvácivých poruch. Znalost molekulární příčiny onemocnění je využívána při genetickém poradenství a pomáhá odhadnout riziko závažné komplikace standardní léčby (inhibitor faktoru VIII). Deficit faktoru VIII je způsoben širokým spektrem mutací. Pouze inverze s místy zlomu v intronech 22, respektive 1 se vyskytují častěji. Ostatní mutace je nutno hledat v celém rozsahu 26 exonů kódujících 9 kb mRNA a v přilehlých nekódujících sekvencích. Cílem práce bylo metodicky zajistit urychlení genotypizace hemofilických rodin v České republice využitím analýzy amplikonů jednotlivých exonů genu faktoru VIII pomocí denaturační vysokotlaké kapalinové chromatografie. 

Metody a výsledky.
Citlivost metody jsme ověřovali na panelu vzorků DNA se 49 dříve charakterizovanými různými sekvenčními variantami genu faktoru VIII, celkem ve 21 exonech. Všechny testované sekvenční změny byly snadno detekovány. Testování příbuzných ukázalo velmi dobrou reprodukovatelnost jednotlivých elučních profilů. Navíc se podařilo detekovat kauzální mutace u 4 z 5 zjevně nepříbuzných hemofilických rodin, u kterých nebyla předchozí analýza metodou multiplexní CSGE úspěšná. 

Závěry.
Zavedená metoda významně urychlí genotypizaci rodin s hemofilií A v České republice. 

Klíčová slova:
hemofilie A, gen faktoru VIII, detekce mutací, denaturační vysokotlaké kapalinové chromatografie.