Stanovenie LDL-cholesterolu novými rovnicami Martin a Sampson, porovnanie so starým Friedewaldom na reálnych dátach a na umelom súbore

Overview

Cieľ: LDL-cholesterol (LDL-C) je stanovovaný metódami, ktorých presnosť je významne ovplyvnená v rôznych klinických alebo analytických situáciách. Novo boli popísané dve výpočtové metódy stanovenia LDL-C, rovnica Martin a rovnica Sampson, ktorých vlastnosti porovnávame s Friedewaldovou rovnicou.

Súbor a metódy: Vzájomné porovnávania LDL-C stanovené uvedenými 3 rovnicami boli vykonané na 4 reálnych súboroch lipidových dát, vytvorených pri rôznych predošlých štúdiách, o rozsahu od n = 140 po n = 7 393 a na nami novo navrhnutom umelom súbore dát.

Výsledky: Rozdiel medzi hodnotami LDL-C stanovenými rôznymi rovnicami sa postupne zväčšuje so znižovaním hladín LDL-C, a to rovnako v podskupine nízkych hodnôt TG aj podskupinách stredných a vyšších hodnôt TG. Platí to pre všetky 4 reálne súbory aj pre umelý súbor. Tieto rozdiely sú tým viditeľnejšie, čím väčší je rozsah súboru. Pre umelý súbor bola celková zhoda medzi kategóriami LDL-C najnižšia pri porovnaní Friedewaldovej a Martinovej rovnice (83,1 %), vyššia medzi rovnicami Sampson a Martin (88,9 %) a najvyššia pri porovnaní rovníc Friedewald a Sampson (90,9 %). Vo všetkých 4 reálnych súboroch boli trendy nadhodnotenia a podhodnotenia medzi rovnicami úplne rovnaké ako v umelom súbore.

Záver: Výsledky klinických aj epidemiologických štúdií sú výrazne ovplyvnené použitou metódou stanovenia LDL-C. Pri porovnávaní výpočtových metód stanovenia LDL-C je možné s výhodou použiť popísaný umelý súbor.

Klíčová slova:

LDL cholesterol – Friedewaldova rovnica – rovnica Martin/Hopkins – rovnica Sampson – porovnanie metód

Úvod

 Impulzom pre túto prácu sa stala veta „Hlavním požadavkem pro klinickou prax nyní bude implementace guidelines do praxe.“ (1), ktorá sa vzťahuje ku novým doporučeniam európskych spoločností pre manažment dyslipidémií (2). Cholesterol v lipoproteínoch s nízkou hustotou (LDL-cholesterol, LDL-C) v krvnom sére zostáva aj v týchto guidelinoch primárnym terapeutickým cieľom pre prevenciu aterosklerotických kardiovaskulárnych onemocnení. Je v nich krátka stať o metódach stanovenia LDL-C, so zhrnutím „Aby sa vyhlo niektorým problémom s Friedewaldovým vzorcom, bolo navrhnutých niekoľko modifikácií výpočtu LDL-C, ale je potrebné dokázať, či tieto zmeny sú lepšie ako Friedewaldov vzorec pre odhad kardiovaskulárneho rizika“. V rovnakom čase vydané ďalšie doporučenia európskych spoločností (3) majú už iné znenie „Modifikovaná rovnica Martin-Hopkins môže byť výhodnejšia pre výpočet LDL-C“, čo je potrebné čítať ako Modifikovaná Friedewaldova rovnica Martin-Hopkins. Nakoniec, Martin-Hopkins rovnica je menovite doporučovaná už aj v niektorých národných klinických guidelinoch, postupne odvodzovaných od uvedených dvoch európskych guidelinov, napr. v poľskom (4), a podporu jej vyslovujú aj maďarskí autori (5).

Metodiky stanovenia LDL-C majú od publikovania Friedewaldovej rovnice (6) už takmer 50-ročnú históriu vývoja. Vývoj ide dvoma smermi. Jeden – meranie – sa snaží vyvinúť a vyrobiť primerane, resp. dostatočne harmonizované a štandardizované diagnostiká na priame meranie LDL-C, čo sa zatiaľ nie celkom darí (7). Druhý – stanovenie výpočtom – je postavený na predpoklade, formulovanom už vo Friedewaldovej práci, že LDL-C je možné s dostatočnou presnosťou vypočítať z iných, v sére nameraných lipidových parametrov, najčastejšie z celkového cholesterolu (TC), HDL-cholesterolu (HDL-C) a triacylglycerolov (triglyceridov, TG).

Friedewaldova rovnica sa stala najbežnejšie používanou metódou stanovenia LDL-C v klinických laboratóriách na celom svete, stále ňou zostáva (a môže byť bed side dopočítaná klinikom). Európskou federáciou laboratórnej medicíny bol v roku 2019 vykonávaný dotazníkový prieskum, zameraný na manažment dyslipidémií, ktorého sa zúčastnilo 452 laboratórií z 28 štátov Európy (z nich 2 laboratóriá z ČR a 0 zo SR). Zo zverejnených anonymizovaných výsledkov (8) okrem iného vyplýva: 44 % laboratórií používa Friedewaldov výpočet, 0 % výpočet inou rovnicou, 34 % rutinne u všetkých pacientskych vzoriek meranie niektorou priamou metódou, 22 % aj výpočet aj meranie, podľa rôznych kritérií. Paralelne bol vykonaný v auguste 2019 obdobne koncipovaný dotazníkový prieskum ktorého sa zúčastnilo 215 českých a slovenských laboratórií (9). Podľa jeho výsledkov 24 % laboratórií používa iba Friedewaldov výpočet, 59 % iba priame meranie, 11 % výpočet aj meranie.

Obmedzenia Friedewaldovej rovnice sú dobre popísané. V snahe zlepšiť validitu bolo postupne odvodených niekoľko desiatok iných matematických rovníc na výpočet LDL-C. Ich úplný výpočet do roku 2010 bol publikovaný v systematickom prehľade (10) a pribúdajú ďalšie.

Od roku 2013 bola publikovaná séria prác s veľmi dobre doloženým výpočtom novej rovnice, ktorej názov sa ustálil, po prvotnom označení Novel method, na Martin/Hopkins, alebo Martin formula (11). V USA je na niektorých pracoviskách už rutinne používaná (12).

V tomto roku bola publikovaná ďalšia, sofistikovaná rovnica prvej autorky Maureen Sampson, Sampsonovej rovnica (13), ktorá okamžite vzbudila veľké očakávania a publikačné odozvy.

Z metodologického hľadiska možno všeobecne identifikovať dve slabé stránky porovnávania dvoch metód na stanovenie toho istého laboratórneho parametra, ktorými aplikovane na stanovenie LDL-C sú: 1. Každá publikácia má uvedenú vetu „merania boli vykonané na našom súbore pacientov“. Výsledky porovnania závisia od štruktúry súboru, na ktorom sa merania robia (inkluzívne a exkluzívne kritériá pre pacientov, veľkosť súboru, najnižšia a najvyššia hodnota lipidu v súbore, medián hodnôt, atď.) Preto porovnanie tých istých dvoch metód, z ktorých aspoň jedna je meraná (nie vypočítavaná) môže na dvoch rôzne zostavených a definovaných súboroch priniesť veľmi rozdielne výsledky. 2. Nová metóda sa neporovnáva s metódou zlatého štandardu, ktorou je preparatívna ultracentrifugácia s beta kvantifikáciou, ale vo veľkej časti prác buď s niektorou z priamych metód merania alebo s niektorou inou výpočtovou metódou. Do roku 2010 bolo identifikovaných spolu 63 porovnávacích štúdií, z nich 27 % porovnávalo beta kvantifikáciu s rôznymi rovnicami, 48 % niektorú z priamych metód s rôznymi rovnicami a 25 % rôzne rovnice medzi sebou (10). Tým samozrejme dochádza ku porovnávaniu novej metódy s metódami zaťaženými oproti zlatému štandardu rôzne veľkými systematickými chybami.

V tejto práci porovnávame hodnoty LDL-C získané Friedewaldovou rovnicou s hodnotami získanými rovnicami Martin a Sampson, na niekoľkých reálnych súboroch. Zároveň prezentujeme porovnanie uvedených rovníc na umelom súbore dát, vytvorenie a význam ktorého sme teoreticky popísali (14) a teraz konfrontujeme s reálnymi dátami.

Materiál a metódy

„ Umelý súbor. Navrhli sme vytvorenie umelého súboru (synthetic data set), v ktorom sú zastúpení „probandi“ s rovnomerne rozloženými hodnotami cholesterolu, HDL-cholesterolu a triglyceridov, v odstupe 0,5 mmol/l, v rozpätí, ktoré zahŕňa hraničnú oblasť medzi fyziologickými a patologickými hodnotami. Po rozbore 7 veľkých reálnych súborov pacientov, ktoré boli použité v dobre dokumentovaných lipidologických štúdiách (podrobnosti viď 14) bolo rozpätie hodnôt zvolené tak, aby zahŕňalo 95 až 99% hodnôt týchto súborov. Výsledná matrica hodnôt je uvedená v tabuľke 1.

Matrica 13 × 6 × 12 poskytuje 936 možných kombinácií. Z nich 36 kombinácií znamená negatívnu hodnotu non-HDL-cholesterolu, preto boli ako nereálne vynechané. Zostávajúcich 900 kombinácií predstavuje 900 členov umelého súboru.

„ Súbor Bratislava. Súbor popísaný v práci (15). V pôvodnej práci sa vyhodnocoval vzťah medzi aterogénnou dyslipidémiou, hypotyreózou a hypertyreózou a účinok liečby na lipoproteínové spektrum u pacientov s hypotyreózou a hypertyreózou pred liečbou a počas liečby.

„ Súbor HepaMeta. Súbor popísaný v práci (16). Dáta z prierezovej štúdie HepaMeta. Údaje boli získané od pacientov rómskej a nerómskej (kaukazskej) populácie. Cieľom tohto projektu bolo zmapovať výskyt vírusovej hepatitídy B a metabolického syndrómu v populácii žijúcej na východnom Slovenskom.

„ Súbor Kamezaki. Súbor popísaný v práci (17). Charakteristika súboru: Zamestnanci Nuclear Science Research Institute, Tokai-mura, Japonské cisárstvo, preventívne vyšetrení v júni 2009.

„ Súbor Pool ČR + SR. Pool všetkých vzoriek od 7 laboratórií zo Slovenska a 5 laboratórií z Česka, poskytnutých pri riešení výskumného grantu Slovenskej kardiologickej spoločnosti 2009–2011. Podrobnosti sú uvedené v práci (18). Charakteristika súboru: Konsekutívne súbory vzoriek krvi doručené do príslušných laboratórií od januára do marca 2010, bez popisu dôvodu indikácie vyšetrenia.

Výber súborov bol robený s úmyslom overiť, ako sa rozsah súboru prejavuje na rozložení a tvare grafov.

Základné demografické údaje a hodnoty antropometrických a biochemických vyšetrení všetkých 5 súborov sú uvedené v tabuľke 2. Tabuľka vznikla kompiláciou údajov uvedených v pôvodných prácach, časť údajov bola dopočítaná.

Rozloženie hodnôt TC, HDL-C a TG v súboroch bolo vykreslené dvojrozmernými bodovými grafmi. Na posúdenie kompatibility medzi výpočtami LDL-C rovnicami podľa Friedewalda, Martina a Sampsona sa použilo niekoľko prístupov. Boli urobené výpočty zhody a nezhody medzi kategóriami LDL-C vytvorenými klinicky relevantnými hranicami: < 1,81 mmol/l; 1,81–2,56 mmol/l; 2,57–4,90 mmol/l; > 4,90 mmol/l, čo zodpovedá < 70 mg/dL, 70–99 mg/dL; 100–189 mg/dL; > 189 mg/dl. Nezhoda medzi výpočtami LDL-C, v stratifikovaných kategóriách podľa výšky TG, bola vizuálne hodnotená s použitím Bland-Altmanových grafov s výpočtom absolútnych rozdielov na zvislej ose grafov. Kategórie TG boli zvolené nasledovne: < 1,69 mmol/l; 1,69–2,25 mmol/l; 2,26–4,50 mmol/l, čo zodpovedá < 150 mg/dL; 150–199 mg/dL; 200–399 mg/dL. Hodnoty v mg/dL pre LDL-C aj TG uvádzame preto, lebo tieto jednotky sú používané v minimálne 7 štátoch Európy (8) a vo veľkej časti ostatných kontinentov a vo veľkej časti literatúry.

Na všetky výpočty a vykreslenia všetkých grafov bol použitý MedCalc Statistical Software verzia 19.4.0 (MedCalc Software Ltd, Ostend, Belgium; https://www.medcalc.org; 2020).

Výsledky

Obrázky 1, 2 a 3 ilustrujú rozloženie dvojíc hodnôt TC, HDL-C a TG v reálnych súboroch v porovnaní s rozložením v umelom súbore. Umelý súbor zahŕňa 99,8 % hodnôt súboru Kamezaki, 99,3 % súboru HepaMeta, 98,3 % súboru Bratislava a 97,4 % súboru Pool. Rozloženie hodnôt je v rôznych súboroch rôzne.

Pre výpočty a grafy prezentované ďalej boli z reálnych súborov vylúčené všetky hodnoty TG nad 4,50 mmol/l. V umelom súbore boli ponechané z didaktických dôvodov aj vyššie hodnoty TG.

Pre umelý súbor bola celková zhoda medzi kategóriami LDL-C najnižšia pri porovnaní Friedewaldovej a Martinovej rovnice (83,1 %), vyššia medzi rovnicami Sampson a Martin (88,9 %) a najvyššia pri porovnaní rovníc Friedewald a Sampson (90,9 %). V porovnaní s Friedewaldom obe rovnice Martin a Sampson vykazovali vysoký podiel reklasifikácie smerom nahor (16,9 % a 8,9 %) a nízky podiel reklasifikácie smerom dole (0,0 % a 0,2 %). V porovnaní so Sampsonovou metódou Martinova rovnica preklasifikovala 10,7 % pacientov do vyššej kategórie a 0,4 % do nižšej kategórie.

Vo všetkých 4 reálnych súboroch boli trendy nadhodnotenia a podhodnotenia medzi rovnicami úplne rovnaké ako v umelom súbore. Relatívne počty nadhodnotených aj podhodnotených pacientov silne kolísali, v závislosti na rozložení hodnôt TC, HDL-C a TG v jednotlivých súboroch. Najvyšší počet celkovej zhody bol v súbore Bratislava, porovnanie Friedewald a Sampson (98,6 %), najnižší počet celkovej zhody bol v súbore Pool, porovnanie Friedewald a Martin (82,9 %).

Na obrázkoch 4, 5 a 6 Bland-Altmanove grafy ukazujú, že rozdiel medzi hodnotami LDL-C stanovenými rôznymi rovnicami sa postupne zväčšuje so znižovaním hladín LDL-C, a to rovnako v podskupine nízkych hodnôt TG aj podskupinách stredných a vyšších hodnôt TG. Platí to pre všetky reálne súbory a rovnako aj pre umelý súbor. Tieto rozdiely sú tým viditeľnejšie, čím väčší je rozsah súboru.

Diskusia

LDL-cholesterol je zásadný laboratórny parameter, primárny terapeutický cieľ dyslipoproteínémií, metabolických ochorení hromadného výskytu. Je stanovovaný metódami – či priamymi alebo nepriamymi – u ktorých je známe, že presnosť nimi získaných výsledkov je významne ovplyvnená v rôznych klinických alebo analytických situáciách. Prehľad uvádza tabuľka 4.

Pokým nebude vytvorená a daná na trh dostatočne presná metóda, a to vo všetkých uvedených situáciách, budú pokračovať pokusy s nepriamymi metódami stanovenia LDL-C. Inou možnosťou do budúcna by bolo nahradenie LDL-C ako primárneho terapeutického cieľa, niektorým iným laboratórnym parametrom (20). Zároveň ale pripomeňme, že v nedávnej minulosti sa do tejto pozície intenzívne presadzoval HDLcholesterol, čo sa však ukázalo ako slepá cesta, korelácia bez kauzality, ako precízne popisujú Davey Smith a Phillips (21).

Prezentované výpočty a grafy dokladujú, že medzi hodnotami LDL-C stanovenými rôznymi troma rovnicami sú rozdiely, ktoré sa zväčšujú s nízkymi aj vyššími hodnotami TG, a nezávisle od hodnôt TG aj s nízkymi hodnotami LDL-C. Ku rovnakým záverom došla aj štúdia Zafrir a spol (22) a pri porovnaní 12 rovníc aj štúdia Piani a spol (23).

V úvode sme popísali dve metodologicky slabé stránky porovnávania metód stanovenia LDL-C. Použitie umelého súboru je spôsob, ktorým možno prvú z nich eliminovať. Ak sa budú výpočtové metódy stanovenia LDL-C, popísané v minulosti či novo navrhované, porovnávať na štandardnom umelom súbore, odpadne veľký prvok neistoty merania vyplývajúci zo zloženia výskumného súboru pacientov, na ktorom je porovnávanie vykonávané. Porovnanie bude kedykoľvek a kdekoľvek reprodukovateľné. Presnejšie povedané, raz vykonané výpočty budú nemenné a všeobecne platné. Prezentované grafy dokladujú, že porovnávania na umelom súbore poskytujú rovnaké výsledky ako porovnávania na reálnych súboroch. Čím je reálny súbor početnejší, tým viac sa tvar príslušných grafov približuje tvaru grafov z umelého súboru. Druhú slabú stránku tento postup úplne eliminovať nedokáže. Z jasných dôvodov nemôžeme vykonať meranie LDL-C na umelom súbore metódou preparatívnej ultracentrifugácie. Bola preto navrhnutá ako „kvázi gold standard“ (reference measurement procedure) pre porovnávacie štúdie metóda, ktorá je, podľa dnešného stavu pozna nia, najspoľahlivejšou výpočtovou metódou stanovenia LDL-C, rovnica Martin. Eliminuje sa tým aspoň prvok neistoty spočívajúci v tom, že sa ako „náhradný gold standard“ v rôznych výskumoch a rôznych publikáciách používa buď široká škála priamych metód merania LDL-C – nedostatočne vzájomne harmonizovaných a zaťažených rôzne veľkými chybami; alebo – zo zotrvačnosti či zo zvyku - Friedewaldova rovnica, ktorej podstatne vyššia miera nepresnosti oproti Martinovej rovnici je overená.

Záver: Spektrum metód na stanovenie – opatrnejší termín je odhad – LDL-C sa rozšířilo o ďalší výpočet, metódu Sampson. Vzhľadom na možnú nepresnosť merania LDL-C je v klinickej praxi u osôb so zvýšenými TG, s dyslipoproteínémiou, diabetes mellitus, obezitou a veľmi nízkym LDL-C doporučené rutinne merať apoB a vypočítať non HDL-C (2). Laboratóriá by mali vo výsledkovej listine uvádzať metódu použitú pri stanovení LDL-C. Pri porovnávaní výpočtových metód stanovenia LDL-C je možné s výhodou použiť popísaný umelý súbor. Tento príspevok priniesol upozornenie na výrazné ovplyvnenie akýchkoľvek retrospektívnych aj prospektívnych klinických štúdií aj epidemiologických štúdií použitou metódou stanovenia LDL-C.

Poďakovanie Za poskytnutie údajov spracovávaných v tejto práci ďakujeme: MUDr. Mgr. Zuzana Mináriková, PhD, IV. interná klinika LF UK a UN Bratislava, Slovenská republika; prof. MUDr. Peter Jarčuška, PhD a MUDr. Martin Janičko, PhD, obaja I. interná klinika LF UPJŠ a UN L. Pasteura Košice, Slovenská republika; Fumihiko Kamezaki, M.D., PhD, 2nd Department of Internal Medicine, University of Occupational and Environmental Health, Kitakyushu, Japan.

KORESPONDENČNÍ ADRESA AUTORA:

MUDr. Rudolf Gaško

Oddelenie klinickej biochémie a hematológie, Psychiatrická nemocnica Michalovce, n. o., Michalovce

Psychiatrická nemocnica Michalovce, n. o., Andreja Hrehovčíka 185/1, 071 01 Michalovce, Slovenská republika

Článek přijat redakcí: 7. 9. 2020

Článek přijat po recenzích k publikaci: 21. 1. 2021