Nehematogenní působení erytropoetinu

Overview

Cytokin erytropoetin je hlavním hematopoetickým faktorem a je syntetizován převážně v ledvinách. Erytropoetin a jeho receptory se však vyskytují i v některých dalších tkáních a mají pleiotropní účinek mimo krvetvorbu. Erytropoetin má antiapoptotickou účinnost a má potenciální neuroprotektivní, nefroprotektivní a kardioprotektivní úlohu při ischemii a jiných tkáňových poškozeních. Má také svou úlohu v angiogenezi, neurogenezi a imunitní odpovědi. Může také zabraňovat některým nepříznivým metabolickým odchylkám, cévní a nervové degeneraci a aktivaci imunitních buněk. U diabetických pacientů snižuje hyperglykemii a zpomaluje průběh proliferativní retinopatie. Z těchto důvodů může erytropoetin mít svou léčebnou cenu v řadě různých onemocnění. Tento krátký přehled dává možnost nahlédnout do nehematologické role erytropoetinu, do jeho mechanizmů působení a možností využití k léčbě. K odstranění nebo snížení možné polycytemie po podání erytropoetinu byla připravena analoga bez hematopoetické účinnosti, která byla testována na zvířatech nebo v několika případech i v klinických studiích.

Klíčová slova:

diabetes – energetický metabolizmus – erytropoetin – pleiotropní působení – proliferativní (diabetická) retinopatie – tkáňově protektivní účinek

Úvod

V roce 1890 pozoroval Francois-Gilbert Viault, francouzský lékař a profesor anatomie v Bordeaux, že po 2 týdnech cesty z Limy v Peru od hladiny moře do horské oblasti Morococha (4 200 m n. m.) vzrostl počet jeho červených krvinek z 5,0 × 10⁶/mm³ na 7,1 × 10⁶/mm³. Byl to první doklad o regulaci tvorby erytrocytů. Již v roce 1903 existenci hormonu řídícího produkci červených krvinek v experimentu prokázal francouzský lékař Paul Carnot a nazval ho hémopoïétine. Následně bylo obtížné reprodukovat jeho pokusy, což vedlo k pochybnostem a zapomnění. Až v roce 1947 finská lékařka Eva Bonsdorff pokusy úspěšně zopakovala a následně izolovala aktivní substanci, kterou nazvala érythropoïétine. Přečištěný erytropoetin (EPO) byl však získán až v roce 1977. V roce 1985 byl izolován gen pro EPO a uměle připravený erytropoetin byl poprvé použit k úspěšné léčbě anémie v roce 1987. V současnosti umožňuje dostupnost rekombinantního lidského erytropoetinu účinnou léčbu některých anémií, zejména u chronického renálního selhání, u infekcí viry vyvolávajícími imunodeficienci nebo u Crohnovy nemoci a ulcerózní koliti­dy, u peri­operativních anémií, zejména v gynekologii, u anémií navozených chemoterapií nebo u postradiačních myelo­dysplazií.

V hematologii je tedy erytropoetin již pevně zabydlen. Novější poznatky však upozorňují, že tento hormon má i účinky mimo krvetvorbu a že tyto aktivity pravděpodobně v dohledné době rozšíří jeho užití a zejména užití jako modifikovaných analog i na další medicínské obory.

Erytropoetin

Erytropoetin je glykoproteinový hormon složený ze 165 aminokyselin o molekulové hmotnosti 30,4 kDa. Spolu s dalšími faktory podporuje tvorbu červených krvinek. Největší podíl EPO vzniká v intersticiálních fibroblastech ledviny v těsném sousedství peritubulárních kapilár, asi v 10 % je také produkován v perisinusoidálních buňkách jater. Jaterní produkce převažuje ve fetálním a perinatálním období. V malém množství vzniká erytropoetin také v některých jiných tkáních, např. v mozkových pericytech nebo v retině. U zdravého člověka se jeho koncentrace v krevním oběhu pohybuje v rozmezí 5–30 IU/ml.

Molekula EPO je tvořena 4 helixy (α-δ nebo A-D) a je stabilizována sirnými můstky. Pro erytropoetickou aktivitu je nejdůležitější helix A a B a z jejich složení jsou odvozeny některé jednodušší molekuly s erytropoetickou účinností.

Úloha erytropoetinu v krvetvorbě

Podnětem pro tvorbu erytropoetinu je hypoxie; hypo­xický signál je přenášen transkripčním faktorem indu­kovaným hypoxií (HIF). Hladina EPO se zvyšuje i pod vlivem glukokortikoidů, androgenů, hormonů štítné žlázy nebo růstového hormonu. Spolu s dalšími faktory, jako je kyselina listová, železo nebo vitamin B₁₂, stimuluje v kostní dřeni diferenciaci pluripotentních hematopo­etických buněk směrem do červené krevní řady a zvyšuje tak tvorbu erytrocytů. Mechanizmus jeho působení na krvetvorbu byl detailně prozkoumán. Erytropoetin cirkuluje v krvi s 7–8hodinovým poločasem a váže se na erytropoetinový receptor (EPOR), který je v případě hematogenní aktivity EPO dimerem (EPOR)₂ základní jednotky. Odhaduje se, že vazebných míst je asi 1 000/buňku. Vazba EPO na (EPOR)₂ na povrchu progenitorových buněk pro červené krvinky aktivuje signální kaskádu JAK2 a ta otvírá cesty STAT5, PIK3 a Ras MAPK pro diferenciaci, přežití a proliferaci erytroidních buněk.

V souvislosti se schopností EPO zvyšovat počet červených krvinek, a tím zlepšovat sportovní výkon, je EPO také ve značné míře zneužíván ve sportovním dopingu, obzvláště ve vytrvaleckých disciplínách, s cílem dosáhnout polyglobulii, a tím zvýšit VO_2max a aerobní kapacitu. Ve sportu je doping EPO od roku 1990 zakázán.

Erytropoetin a nehematogenní působení

Skutečnost, že receptory pro erytropoetin se mimo kostní dřeň nacházejí na mnoha dalších místech organizmu – v mozku, ledvinách, v retině, v některých solidních nádorech – vedla k úvahám, zda neexistují další aktivity EPO mimo jeho hematopoetické působení. Bylo zjištěno, že EPO má protektivní efekt v řadě orgánů, zejména v ledvině a srdci a že zmirňuje neuropatické bolesti [1–4]. Experimentální výsledky vedly k závěrům, že tento protektivní mechanizmus má povahu multifaktoriální a že zahrnuje inhibici apoptické buněčné smrti a stimulaci buněčné regenerace a inhibici cest vedoucích k orgánovým poškozením.

Mechanizmus nehematogenního působení

V odpovědi na poškození tkání pak EPO působí protektivně prostřednictvím receptoru TPR (Tissue Protective Receptor), který je složen z monomerního receptoru pro EPO (EPOR) a β-obecného receptoru (β Common Receptor – βCR). Zatímco afinita erytropoetinu k (EPOR)₂ je vysoká, k složenému receptoru EPOR/βCR je podstatně nižší a k jeho aktivaci k protektivní tkáňové účinnosti je třeba vyšší koncentrace EPO než k stimulaci červené krvetvorby [5].

Spektrum nehematologického působení erytropoetinu

Erytropoetin a jeho receptory jsou exprimovány v různých tkáních, ve kterých vyvolávají pestré aktivity a mají různé účinky na nehematogenní buňky. Erytropoetin má antiapoptické vlastnosti a schopnost neuroprotekce a kardioprotekce při ischemii. Ovlivňuje také angiogenezi, neurogenezi a imunitní odpověď. Je schopen zabraňovat některým nepříznivým metabolickým změnám, neuronální a vaskulární degeneraci a aktivaci prozánětlivých cytokinů, stimuluje hojení po zranění a zabraňuje destrukci tkáně v okolí rány. Proto může erytropoetin mít léčebné účinky ve velmi různých situacích.

Nedořešenou otázkou je úloha často pozorované exprese EPOR v nádorové tkáni, která by mohla vést k předpokladu, že průběh onemocnění je erytropoetinem zhoršován. Nezdá se však, že by tato skutečnost hrála roli v progresi tumorů [6]. EPO terapie je u nádorů využívána hlavně k udržení koncentrace hemoglobinu a ke snížení únavy. V případě kolorektálního karcinomu je účinek EPO využíván terapeuticky s dobrým výsledkem [7].

Receptory pro EPO jsou exprimovány v neuronech i v astrocytech glie ve specifických oblastech mozku, EPO je přítomen v cerebrospinální tekutině. Přesvědčivé doklady máme o tom, že EPO v mozku působí jako neurotropní a neuroprotektivní faktor. EPO zabraňuje zániku nervových buněk z důvodu poškození hypoxií nebo kyselinou glutamovou a podporuje neuronální přežití při mozkové ischemii. EPO hraje roli ve vývoji a maturaci mozku a má neurotropní a neuroprotektivní účinky v různých situacích poškození mozku, jako je hypo­xie, cerebrální isch­emie nebo subarachnoidální hemoragie [1,2]. Neuroprotektivní schopnosti EPO byly potvrzeny i v klinické praxi u pacientů s akutním iktem. Potvrzena byla i regenerace nervové soustavy po spinálním poškození [8]. EPO má též široké spektrum působení na kognitivní funkce. Zlepšuje kognitivní výkon u schizofrenie, u pacientů s bipolární poruchou zlepšuje pozornost, rozpoznávání tváří a urychluje zpracování informací v průběhu učení ve srovnání s placebem. U pacientů s depresí může EPO posilovat rozpoznávání, paměť a verbální schopnosti [9].

Vliv EPO na cévní systém se týká jak působení na endo­tel, tak na hladké svalstvo. EPO podporuje angiogenezi, stimuluje produkci endotelinu a dalších vazoaktivních mediátorů. Receptory EPOR se nalézají i v kardiomyocytech a úloha EPO jako myokardiálního protektivního faktoru je v současnosti předmětem zájmu medicínského výzkumu [2].

EPO receptory byly prokázány jak v proximálních, tak v distálních tubulech ledvin. Včasné podávání EPO zpomaluje progresi renálního selhání [10]. Snižuje chronickou hypoxii ledvin a následné poškození tubulointersticiálního systému. O mechanizmu tohoto efektu byla vedena diskuse, zda není spíše důsledkem hemato­poetického působení EPO, protože zvýšení hemoglobinu samo má protektivní efekt na tubulointersticium. Ve prospěch názoru, že jde o nehematopoetické působení, svědčí klinický výsledek studií o působení karbamyl-erytropoetinu (CEPO), analoga EPO bez hemato­poetické účinnosti. CEPO měl významný protektivní účinek při poškození ledvin ischemií/reperfuzí nebo unilaterální obstrukcí [11].

Erytropoetin a energetický mechanizmus

Jedním z prvních podnětů zkoumání účinku EPO na glukózový metabolizmus byl klinický poznatek, že u dialyzovaných diabetiků při léčbě anémie se snižuje jejich glykemie a inzulinová rezistence [12], při čemž nálezy nesvědčily pro přímou souvislost zlepšení glukózového metabolizmu s úpravou anémie. U pacientů s diabetem, a to i u těch, kteří byli bez komplikací, byl zaznamenán častější deficit EPO než u zdravých osob [13,14]. Závěry z desítek klinických pozorování byly podpořeny výsledky pokusů na zvířatech, zejména na obézních myších [15,16]. U potkanů při sledování metabolizmu značené glukózy bylo zjištěno [17], že podání erytropoetinu signifikantně snížilo glykemii a že záchyt glukózy byl významně zvýšen v adipocytech kultivovaných v prostředí se zvýšenou koncentrací glukózy, ale nikoli při její normální koncentraci. Pod vlivem EPO byla zvýšena fosforylace kináz ERK (extracelulárním signálem regulovaná kináza) a Akt (protein kináza B) a záchyt [³H]-deoxy-D-glukózy v důsledku zvýšené aktivity transportéru Glu4 na buněčné membráně.

Pokusy na zvířatech ukázaly, že EPO působí zejména na tukovou tkáň a na osu hypotalamus-hypofýza-nad­ledvina [18] a že tyto efekty nejsou závislé na hematopoetické účinnosti EPO. Podávání EPO pokusným zvířatům, ale i podávání lidem [19], zlepšuje glykemickou kontrolu, snižuje glykemii a hladiny inzulinu v krvi, snižuje hmotnost a podíl tukové tkáně, inzulinovou rezistenci a zlepšuje glukózovou toleranci. Na glykemii je závislý i počet receptorů pro EPO, hyperglykemie indukuje zvýšení jejich počtu [20]. Cesty, jakými EPO v glukózovém metabolizmu působí, jsou multifunkční a byly hledány ve vlivu na sekreci proopiomelatoninu v hypotalamu nebo ACTH hypofýzou [21], ve zlepšení záchytu glukózy v kosterním svalstvu [22], ve zvýšené oxidaci ve svalech [23], ve snížení glukoneogeneze [24], v působení na hnědou tukovou tkáň a termogenezi [15], a to za účasti PPARα (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor α) a sirtuinu Sirt1 [16,25], nebo ve snížení známek zánětu v tukové tkáni [26]. Potvrzena byla i vyšší aktivita pankreatických B-buněk [27]. Objevil se i názor, že jde o nespecifický důsledek úpravy mikrocirkulace [28].

Erytropoetin a proliferativní retinopatie

Diabetická retinopatie patří mezi časté poruchy zraku – podle WHO je její podíl na celosvětové prevalenci slepoty 1 %. Onemocnění v první fázi je neproliferativní poruchou, která může přejít do proliferativní retinopatie nebo do diabetického makulárního edému. Oba tyto stavy hrozí slepotou, a i když jsou makroskopicky zcela rozdílné, je jejich příčina společná. Je jí mikroangiopatie vyvolaná narušením hematoretinální bariéry. Nejvážnější a pro zrak nejnebezpečnější děj je pak kontrakce fibrózní složky proliferace, která je hlavní příčinou trakčního odchlípení sítnice.

V poslední době bylo potvrzeno nejméně 16 faktorů protektivních pro retinu, které by mohly být východiskem pro nové potenciální směry v léčbě diabetické retinopatie. Jedním z nich je erytropoetin, který působí v oblasti ochrany těsných spojů v hematoretinální bariéře [29].

Erytropoetinovou mRNA v retině a erytropoetin ve sklivci lze prokázat u člověka již v embryonálním stadiu a v této době je koncentrace v sklivci vyšší než v krevním oběhu. To, že EPO hraje roli ve vývoji sítnice, potvrzují i zkušenosti s retinopatií předčasně narozených dětí. Na rozdíl od pokusných zvířat a dětí porozených v termínu není u nedonošenců retina vaskularizována. Erytropoetin v časném poporodním období podporuje vaskularizaci sítnice, ale také má některé neuroprotektivní účinky, např. zlepšuje kognitivní schopnosti v dětství [30].

Při analýzách očních struktur v postmortem vzorcích byl EPO i jeho receptor nalézán v sítnici, především v neuroretině. Koncentrace u diabetiků bez zjevné retinopatie byly vyšší než u zdravých osob a ještě vyšší byly u diabetiků s proliferativní retinopatií. Hladiny EPO ve sklivci u pacientů s diabetickou retinopatií dosahují 400–500 mU/ml [31] a někteří autoři považují tyto vysoké hodnoty za rizikový faktor, ale většina ostatních spíš za kompenzační neuroprotektivní mechanizmus, tedy spíše za důsledek než příčinu patologických změn při diabetické retinopatii.

Vaskulární endoteliální růstový faktor (VEFG) je významným negativním faktorem vyvolávajícím a prohlubujícím nepříznivé změny ve vaskularizaci sítnice. Podání EPO intraperitoneálně nebo intravitreálně potkanům s diabetem indukovaným streptozocinem snižovalo expresi VEGF, zlepšovalo vaskularizaci a zabraňovalo některým neurodegenerativním změnám diabetické retiny [32]. EPO také pomáhá udržet v buňkách sítnice úroveň intracelulárního zinku, porušenou u diabetu. Dalším přínosem je schopnost snižovat v retině potkanů se streptozocinovým diabetem hladinu některých prozánětlivých cytokinů a VEFG [33]. Podle těchto a dalších dokladů, jako je např. příznivý účinek EPO na diabetický makulární edém, se usuzuje, že EPO má v retině zřejmě neuro­protektivní, antiapoptotický, protizánětlivý, antioxidační a angiogenní účinek [34].

Analoga EPO

Pro terapii anémie slouží celá řada farmaceutických přípravků, které jsou odvozeny od erytropoetinu. V klinické praxi je nejdéle používán epoetin, rekombinantní humánní erytropoetin (rHu-EPO), který je připravován vpravením genu pro lidský EPO do buněk ovarií křečíků čínských. Epoetin α a epoetin β mají totožný peptidový základ a liší se v sacharidové složce. Další variantou je epoetin ω, θ (omega, theta) a ζ (dzéta). Tytéž látky jsou připravovány i synteticky. Darbepoetin je podobně připravován za použití modifikovaného genu pro lidský erytropoetin a pegpoetin β je vyráběn fúzí epoetinu β a metoxypolyetylenglykolu. Všechna tato analoga se váží na mem­bránové receptory EPOR.

Tyto přípravky mají vysokou účinnost na krvetvorbu erytrocytů, což při využívání nehematologických účinků EPO představuje určitou nevýhodu danou potenciálním zvýšením hematokritu nad horní hranici rozmezí a zvýšení krevního tlaku. Polycytemie může vést k hyper­viskozitě krve, jejímž následkem mohou být trombotické komplikace. Proto byla vyvinuta analoga se zachovalou nehematogenní účinností, ale potlačenou schopností podpory tvorby erytrocytů [35]. Tomuto cíli se blíží např. carbamyl-erytropoetin (CEPO), který v pokusu na potkanech se streptozocinovým diabetem zřejmě inhiboval apoptózu a oxidačním stresem vyvolané poškození retinálních buněk, aniž by ovlivnil angiogenezi [36]. Ještě výhodnější se zdá komplexnější zásah do struktury EPO. K sestrojení vhodného peptidu pomáhal poznatek, že ze 4 helixů EPO se na erytropoetické aktivitě podílejí jen 3: A, C a D. Proto byla připravena analoga EPO [3,37,38], která měla neuroprotektivní účinnost a při tom byla zbavena erytropoetické účinnosti, a tím i rizika nežádoucích důsledků erytrocytózy.

Závěr

Erytropoetin kromě klasické hematogenní účinnosti má i další působení s výsledným efektem neuroprotektivním, antiapoptotickým, protizánětlivým, antioxidačním a angiogenním. Zlepšuje také porušenou glukózovou homeostázu. Tyto nehematogenní účinky jsou zprostředkovány jiným receptorovým systémem než účinky hematogenní. Připraveny byly malé peptidy, které vyvolávají pouze nehematogenní efekt erytropoetinu. Zkoušeny byly většinou pouze v preklinických studiích, ale otevírají další cestu ke zlepšení zdravotního stavu diabetiků nejen úpravou glukózového metabolizmu, ale i reno­protekcí a kardioprotekcí.

Podpořeno MZ ČR – RVO (Endokrinologický ústav – EÚ, 00023761).

Doručeno do redakce 10. 1. 2019

Přijato po recenzi 11. 2. 2019

prof. MUDr. et RNDr. Luboslav Stárka, DrSc.

lstarka@endo.cz

Endokrinologický ústav, Praha

www.endo.cz