Vizuální a kolorimetrické hodnocení přítomnosti vyšší hladiny sarkosinu v moči

Overview

Cíl: Karcinom prostaty je nejčastěji vyskytující se zhoubné nádorové onemocnění mužů. Jeho výskyt se geograficky výrazně liší a narůstá s věkem. Pro rychlou diagnostiku jsou hledány vhodné nádorové markery. Velmi slibným kandidátem je aminokyselina sarkosin (SAR), která je zvýšena v moči u zhoubného nádoru. Cílem této práce je vývoj jednoduché, rychlé a spolehlivé metody pro detekci SAR v lidské moči.

Materiál a metody: Vzorky umělé moči (15 typů) byly připraveny podle dostupných protokolů. Elektrochemická analýza byla provedena potenciometricky a voltametricky. Teplotní testy stability sarkosin oxidázy (SOX) byly provedeny při teplotách –5, 25, 30, 35, 40, 45 a 60 °C. Lyofilizace byla provedena po dobu 72 h (0,1 mbar, –80 °C). Na začátku a na konci experimentu byl test hodnocen vizuálně. Získané fotografie byly podrobeny matematické analýze (hodnocení barevné intenzity signálu).

Výsledky: Složení moči je velmi variabilní a obsahuje celou řadu odpadních metabolitů, léčiv a dalších interferentů. Umělá moč je vhodnou matricí pro studium změn aktivity SOX. Aktivita SOX (1 U/ml) byla sledována (Trinderovou reakcí) jako hydrolýza sarkosinu (60 min, 125 µM SAR, 0,4 mM AAP). V experimentu se pozoroval vliv přídavku interferentů (Cd, Pb, Zn a léky), kdy se inhibice SOX pohybovala v rozmezí 10–20 %. Enzym SOX byl zahříván, mražen a lyofilizován. Výsledky ukazují, že enzym je stabilní při teplotách 5–60 °C (pokles signálu o 10 % za 200 h). Teploty nad 60 °C vedou k inaktivaci enzymu (pokles signálu o 90 % při 120 min). Nízké teploty (–5 °C až –20 °C) nevedly po 5 týdnech k poklesu signálu. Vizuální výsledky jsou sumarizovány jako průměrná hodnota denzity RGB signálu v dané studované skupině vzorků (n = 10). Získané výsledky ukazují, že průměrná variabilita RGB signálu mezi jednotlivými testovanými vzorky byla 7,4 %. Z těchto hodnot byla určena ROC křivka jednotlivých experimentů (n = 5). Pomocí ROC křivek byla vypočítána senzitivita (od 0,59 do 0,83) a specificita (1) podle druhu umělých močí. ROC křivky byly z 26,7 % hodnoceny jako výborné, z 66,6 % jako velmi dobré z 6,6 % jako dobré a žádná jako nevyhovující.

Závěr: Byla provedena studie stanovení pro aminokyselinu sarkosin za využití enzymatické reakce. Vizuální vyhodnocení testu ukázalo 100% úspěšnost identifikace přítomnosti sarkosinu v umělé moči. Získaná data ukazují na potenciál metody pro vizuální hodnocení přítomnosti sarkosinu v moči.

Klíčová slova:

sarkosin – zhoubné nádory prostaty – biosenzor – vizuální test

ÚVOD

Karcinom prostaty je nejčastěji se vyskytující zhoubné nádorové onemocnění mužů (1–3). Podle statistik WHO je celosvětově každý rok diagnostikováno více než 1,1 milionu nových případů a evidováno asi 307 tisíc zemřelých mužů. V Evropě je každoročně zaznamenáno asi 190 tisíc nově diagnostikovaných případů a 80 tisíc zemřelých (1). Výskyt karcinomu prostaty se geograficky výrazně liší a narůstá s věkem (1). Pro rychlou diagnostiku jsou hledány vhodné nádorové markery (4–8). Velmi slibným biochemickým kandidátem je aminokyselina sarkosin (N-methylglycin) (9, 10). Sarkosin je aminokyselina, která je součástí metabolických drah glycinu, serinu a threoninu. Sarkosin může vznikat methylací glycinu působením enzymu glycin N-methyltransferázy (EC 2.1.1.20) (11) (obr. 1).

V řadě prací bylo zjištěno, že množství sarkosinu v krvi se pohybuje v jednotkách mikromolárních koncentrací (12, 13). V případě některých onemocnění jako je sarkosinemie a glutarová acidurie typu II se vyskytují zvýšené hodnoty sarkosinu v krvi a moči (13). Sarkosinemie je velmi vzácná metabolická porucha, která nemá přesně definované klinické projevy. U onemocnění dochází k vzestupu hladiny sarkosinu v moči i krevní plazmě (13). Analyzované hodnoty sarkosinu se v těchto případech mohou pohybovat v desítkách až stovkách mikromolárních koncentrací. Uvedená biologická relevance sarkosinu je významná, a proto je důležité hledat vhodné techniky jeho rychlé a spolehlivé detekce. Pro detekci sarkosinu se využívá řady analytických technik: fotometrie, elektrochemie, hmotnostní detekce a kapalinová chromatografie (14–19). Tyto techniky umožňují stanovení aminokyseliny selektivně a vysoce senzitivně (20, 21). Enzymatické metody jsou velmi vhodné pro automatizované stanovení kreatininu, kyseliny močové, triacylglycerolu, cholesterolu, glukózy a případně dalších analytů využívající Trinderovy reakce (22). Reakce je založena na použití vhodného barviva (jako je aminoantipyrin a další vhodné molekuly) v přítomnosti peroxidu vodíku a peroxidázy (23). Při reakci vzniká chinoniminové barvivo, které je vyhodnoceno fotometricky (24, 25). Zavedení této reakce do klinické biochemie přineslo ve spojení se substrátově specifickými enzymy výrazné zlepšení specificity a selektivity (26). Nanomedicínské přístupy přinášejí technologie s vysokou senzitivitou, specificitou a výrazně nižšími provozními náklady a jsou aplikovatelné pro analýzu biomolekul (2, 27, 28).

METODIKA

Kolorimetrické hodnocení. Měření probíhalo na spektrofotometru UV-3100 PC (VWR, USA). Pro měření byly použity plastové kyvety (UV-VIS, BRAND, USA). Do kyvety bylo napipetováno 500 µl činidla a následně 100 µl vzorku. Jako slepý vzorek byl použit reakční roztok. Měření probíhalo v oblasti 250–650 nm. Použité koncentrace sarkosinu byly 0–50 µM. Kalibrační křivka sarkosinu měla koeficient korelace r = 0,998, rovnici regrese y = 0,00239 + 0,00232x, RSD = 2,5 % a LOQ = 3 µM. Spektrofotometrické měření probíhalo také na polystyrenové mikrotitrační destičce, která byla předem promyta 18 MΩ vodou (3krát, 300 µl), za laboratorní teploty pomocí readeru (TECAN, Švýcarsko). Do jamky destičky se pipetovalo 50 µl vzorku a 250 µl činidla.

Vizuální hodnocení. Skleněná lahvička obsahuje zlaté magnetické nanočástice s navázanými enzymy. Celkový objem v lahvičce pro hodnocení je 1000 µl. Reakční roztok obsahuje komponenty pro barevné zviditelnění přítomnosti sarkosinu. Barevná reakce byla vyhodnocena vizuálně a statisticky zpracována v Laboratorním informačním systému (barevná lahvička – pozitivní; bezbarvá lahvička – negativní).

Reakční roztok obsahoval 4-AAP (4-aminoantipyrin), sarkosin oxidázu, křenovou peroxidázu v 0,2 M fosfátovém pufru (pH 8). Po napipetování vzorku do reakčního roztoku probíhala 30minutová inkubace.

Testovací vzorky. Vzorky umělé moči (15 typů) byly připraveny podle dostupných protokolů (29–31).

VÝSLEDKY

Princip kolorimetrického hodnocení sarkosinurie

Aminokyseliny jsou bezbarvé a jejich přímé fotometrické stanovení je obtížné. Vhodnou možností analýzy aminokyselin jsou reakce s chromoforem za vzniku barevných komplexů (32). Sarkosin oxidáza je specifický enzym, který hydrolyzuje pouze aminokyselinu sarkosin na glycin, za vzniku vedlejších produktů peroxidu vodíku a formaldehydu (viz obr. 1A). Následně lze stanovit vzniklý peroxid vodíku za využití Trinderovy reakce (viz obr. 1B) (3, 26, 33, 34). Fenol reaguje s peroxidem vodíku a 4-aminoantipyrinem za katalýzy enzymem peroxidázou a vzniká 4-(p-benzochinon-monoimino)-fenazon detekovatelný spektrofotometricky při 510 nm. Složení přirozené moči je velmi variabilní a obsahuje celou řadu odpadních metabolitů, léčiv a dalších interferentů. Umělá moč je vhodnou matricí pro studium změn aktivity SOX.

Typický obraz provedeného testu na přítomnost sarkosinu je ukázán na obrázku 2. Hraniční koncentrace je velmi dobře rozlišitelná od negativního výsledku (LOD = 5 µM, LOQ = 14 µM, RSD = 20 %). Při splnění této podmínky byl test dále podrobně vizuálně hodnocen. Mezi základní parametr ukazatele vhodnosti testu patří vyhodnocení ROC křivek a tím specificity a senzitivity testu. Byly připraveny testovací série (n = 5), kdy byly na destičky naneseny vzorky močí. Artificiální moč byla obohacena o několik koncentrací sarkosinu (216, 166, 125, 62,5, 31,2, 15,6 a 0 µM). Následně byl přidán reakční roztok a barevná reakce byla vyvíjena po dobu 30 minut (obr. 3) (35). Následně byla každá série vzorků (15 typů umělých močí, 12 opakování v sedmi různých koncentracích sarkosinu) fotograficky zachycena a následně vizuálně hodnocena. Každý provedený test byl hodnocen v nezávislých opakováních (n = 4). Jednotlivé výsledky byly označeny jako pravdivě pozitivní, falešně negativní nebo pravdivě negativní. Výsledky hodnocení byly zpracovány statisticky metodou vyhodnocení ROC křivky (na hladině 95 %). Tabulka 1 shrnuje dosažené výsledky kolorimetrického testu, kdy senzitivita byla 1 (žádný falešně pozitivní výsledek). Specificita testu byla v rozsahu 0,6 až 0,8. Podle běžně dostupné klasifikace byl test hodnocen v 26 % jako výborný, 66 % jako velmi dobrý a 6 % jako dobrý. Výsledky hodnocení vizuálního testu jsou sumarizovány jako průměrná hodnota denzity RGB signálu v dané studované skupině vzorků (n = 10).

Vliv interferentů. V experimentu se pozoroval vliv přídavku interferentů (Cd, Pb, Zn a léčiv, 100 µM), kdy se inhibice SOX pohybovala v rozmezí 10–20 %. Enzym SOX byl zahříván, mražen a lyofilizován. Výsledky ukazují, že enzym je stabilní při teplotách 5–60 °C (pokles signálu o 10 % za 200 h). Teploty nad 60 °C vedou k inaktivaci enzymu (pokles signálu o 90 % za 120 min). Nízké teploty (–5 °C až –20 °C) nevedly po 5 týdnech k poklesu signálu.

Princip vizuálního hodnocení sarkosinurie

Test byl proveden s přídavky sarkosinu (216, 166, 125, 62,5, 31,2, 15,6 a 0 µM) za běžné laboratorní teploty, po dobu 30 minut. Výsledná barevná reakce byla fotograficky zaznamenána. Jednotlivé obrazy byly vizuálně hodnoceny (n = 5). Každý vzorek byl posouzen, zda poskytoval nebo neposkytoval barevnou reakci. LOD byla určena jako koncentrace sarkosinu v moči, kterou bylo možné vizuálně rozpoznat. Všechna získaná data byla následně matematicky vyhodnocena. Byla určena ROC křivka jednotlivých experimentů (n = 4). Pomocí ROC křivek byla vypočítána senzitivita od 0,78 do 1 a specificita 1 podle druhu umělých močí. ROC křivky byly z 26,6 % hodnoceny jako vynikající, ze 46,6 % jako výborné, z 23,3 % jako velmi dobré, z 3,3 % jako dobré a žádná jako nevyhovující (tab. 2).

ZÁVĚRY PRO KLINICKOU PRAXI

Sarkosinurie byla hodnocena kolorimetricky a vizuálně. Ze získaného statistického vyhodnocení testu ROC křivkami byla potvrzena 100% úspěšnost identifikace přítomnosti sarkosinu. Získaná data ukazují na potenciál enzymatické metody pro vizuální hodnocení přítomnosti sarkosinu v moči.

Práce byla realizována za podpory projektu SarkoTest 165/2015 Liga proti rakovině Praha a The European Technology Platform for Nanomedicine.

Konflikt zájmů: žádný.

ADRESA PRO KORESPONDENCI:

prof. Ing. René Kizek, PhD., DrSc., MBA

Farmaceutická fakulta MU

Palackého tř. 1946/1, 612 00 Brno

e-mail: kizek@sci.muni.cz