Výskyt Francisella tularensis subsp. holarctica v hematofágních členovcích na Břeclavsku v roce 2022

ÚVOD

Francisella tularensis je obligátně aerobní, gramnegativní, intracelulární, nesporulující bakterie, náležící do kmene Pseudomonadota, třídy Gammaproteobacteria a čeledi Francisellaceae, která způsobuje akutní onemocnění – tularemii neboli zaječí nemoc. Nákaza se vyskytuje sezonně s nejvyšším počtem případů v pozdních jarních měsících, během léta až do začátku podzimu [1, 2]. Bakterie může infikovat širokou škálu hostitelů včetně bezobratlých, ptáků (stěhovaví pobřežní ptáci) a savců [3]. Za nejvýznamnější savčí hostitele jsou však považováni zástupci řádů zajícovci (Lagomorpha) a hlodavci (Rodentia) [4]. Jako vektoři hrají významnou roli v přenosu hematofágní členovci, a to převážně klíšťata. Role dalších zástupců hematofágních členovců (především komárů) při biologickém přenosu F. tularensis není dosud zcela zřejmá [4]. Mezi další způsoby přenosu řadíme nákazu aerogenní cestou, alimentární přenos nebo nákazu přímým kontaktem [4]. Mezilidský přenos nebyl dosud zaznamenán [5]. Díky mnoha faktorům virulence, poměrně snadnému šíření a nedostupnosti vakcinace představuje tularemie potencionální bioteroristickou zbraň [6]. Jsou popsány čtyři poddruhy tohoto patogenu: F. tularensis subsp. tularensis (typ A), F. tularensis subsp. holarctica (typ B), F. tularensis subsp. mediasiatica a F. tularensis subsp. novicida [4]. Typy A a B jsou považovány za nejdůležitější z hlediska patogenity pro člověka (více virulentní typ A převládá v Severní Americe, mírnější typ B se objevuje především v Eurasii). Klinické příznaky tularemie souvisejí především se vstupní bránou patogenu, stupněm virulence a imunitním stavem pacienta. Na základě místa vstupu a klinických projevů rozlišujeme 4 formy onemocnění, a to ulceroglandulární/okuloglandulární, pulmonární, střevní/abdominální a nejméně častou septickou [7]. Každá z forem tularemie může být doprovázena komplikacemi, které mohou vést k sekundární sepsi, zápalu plic, popřípadě meningitidě.

Cílem práce bylo zmapovat s využitím molekulárních metod aktuální výskyt F. tularensis subsp. holarctica u hematofágních členovců (klíšťat, komárů a muchniček) na vybraných lokalitách Břeclavska. Vzhledem k nárůstu ulceroglandulární formy onemocnění po sání klíštětem je nezbytné získat recentní data o skutečné prevalenci F. tularensis v klíštěcích vektorech a současně objasnit možnou roli dalších zástupců hematofágních členovců jako jsou komáři a muchničky při vektorovém přenosu F. tularensis na našem území.

MATERIÁL A METODY

Sběr klíšťat, komárů a muchniček a lokality sběru

Sběr klíšťat

Sběr klíšťat byl prováděn metodou vlajkování. Odchyt probíhal v létě a na podzim roku 2022 na lokalitách Ladná, Podivín (Janův Hrad), Lanžhot (obora Soutok), Valtice (Rendezvous, Zahrádky, Pískovna) a obora Soutok (Pohansko, Štrosflek). Již při sběru byla klíšťata tříděna a separována dle druhu (Ixodes ricinus, Dermacentor reticulatus, Haemaphysalis concinna), vývojového stadia (nymfa, dospělec) a pohlaví (samec, samice). Do zkumavky bylo ke členovcům umístěno stéblo trávy, aby nedocházelo k jejich vysychání. Vzorky byly uchovány v chladničce při 6 °C a před analýzou sestavovány do směsí, tzn. 1 vzorek odpovídal 10 kusům jedinců samic, samců či nymf. Klíšťata byla následně homogenizována a využita k izolaci DNA. Další vzorky tvořila nasátá klíšťata odebraná z divoké zvěře (srnec obecný, jelen evropský, daněk evropský a prase divoké). Na rozdíl od klíšťat sesbíraných metodou vlajkování nebyly tyto vzorky vyšetřovány ve směsích (jeden vzorek tedy odpovídal 1 jedinci). Tyto vzorky pocházely z lokalit Hlohovec, Mikulov, Poštorná, Strachotín, Tvrdonice a Valtice.

Sběr komárů a muchniček

Odchyt probíhal v létě 2022 pomocí pastí EVS („encephalitis vector surveillance“) od výrobce BioQuip Products, USA s oxidem uhličitým a světlem jako atraktantem. Muchničky byly odchyceny v oblastech Lednice (rybník Mlýnský), Břeclav (Kančí Obora, Obora Soutok) a Tvrdonice. Komáři byli odchyceni v lokalitách Kančí Obora a Obora Soutok (Hvězda). Komáři a muchničky byli zpracováni ve směsích po 100 jedincích. Vzhledem ke složité taxonomické determinaci muchniček byli jedinci zařazeni pouze v rámci rodu Simulium spp. čeledi Simuliidae. Odchycení komáři patřili do druhu Aedes vexans.

Homogenizace vzorků klíšťat, komárů a muchniček Homogenizace vzorků probíhala v chlazených třecích miskách v přítomnosti sterilního písku, kde byly jednotlivé vzorky (nebo jejich směsi) homogenizovány v 500 µl chlazeného fosfátového pufru (PBS) a centrifugovány při 4 °C a 500 otáčkách za minutu po dobu 5 minut. Byl odebrán supernatant, který byl dále zpracován při izolaci DNA.

Izolace genomické DNA

Automatická izolace DNA z hematofágních členovců probíhala pomocí automatického přístroje QIAcube a využitím QIAamp DNA Mini Kit, a to přesně dle instrukcí výrobce.

Real-time PCR

Pro detekci F. tularensis pomocí Real-Time PCR ve vzorcích DNA izolované z členovců byly využity primery zacílené na gen tul4, který kóduje 17-kDa lipoprotein vnější membrány. Primery, sonda i podmínky reakce byly převzaty z publikace Versage et al. (2003) [8]. Navržená PCR nedetekovala tzv. Francisella-like endosymbionty, je tedy vysoce specifická ale i citlivá (schopna detekovat 1 buňku F. tularensis ve vzorku) [9]. V počátečních fázích screeningu jsme používali také interní pozitivní kontrolu (tzv. IPC) pro ověření optimálního průběhu PCR reakce.

Konvenční PCR

Pro konfirmaci Francisella tularensis ve vzorcích DNA izolované z hematofágních členovců a pro sekvenaci byly využity primery cílené opět na konzervativní oblast genu tul4 [10].

Sekvenace pozitivních vzorků

Pozitivní vzorky, tedy produkty konvenční PCR, byly následně osekvenovány a bioinformaticky analyzovány dle studie uveřejněné dříve [11]. Purifikace PCR produktů byla realizována prostřednictvím soupravy DNA Clean & Concentrator-5 Kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA). PCR produkty byly sekvenovány dle pokynů výrobce pomocí BigDye™ Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). K odstranění nečistot byla použita sada ZR DNA Sequencing Clean-up Kit (Zymo Research). Sekvenování probíhalo na ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Pro zajištění vysoké kvality čtení byly PCR amplikony sekvenovány obousměrně. Následně proběhla úprava sekvencí DNA a jejich porovnání pomocí modulu Seqman v rámci Lasergene v. 6.0 (DNASTAR Inc., Madison, Wisconsin, USA). Porovnání bylo následně zkontrolováno také ručně. Výsledné sekvence byly vyhledány v databázi ve formátu FASTA, použitým algoritmem byl BLAST (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/blast).

VÝSLEDKY

Celkem bylo na přítomnost F. tularensis vyšetřeno 4 348 jedinců tří druhů klíšťat (I. ricinus, D. reticulatus, H. concinna), 4 100 jedinců komárů druhu Ae. vexans a 6 900 jedinců muchniček rodu Simulium spp. Údaje o lokalitách sběru, vyšetřených jedincích (druhu, stadiu, pohlaví) a prevalence F. tularensis jsou přehledně shrnuty (tab. 1 a 2). Z celkově vyšetřených 505 vzorků klíšťat, 69 vzorků muchniček a 41 vzorků komárů byly zjištěny 2 pozitivní vzorky. V případě pozitivity se jednalo o vzorek číslo 114 (směs samic D. reticulatus, lokalita Ladná, metoda vlajkování) a vzorek číslo 404 (jedinec D. reticulatus, lokalita Poštorná, odběr ze srnce obecného). Pozitivita těchto dvou vzorků byla určená pomocí Real-Time PCR a následně ověřena i konvenční PCR a elektroforézou. Pro porovnání sekvenční homologie vzorku 114 s jinými sekvencemi dostupnými v GenBank databázi Národního centra pro biotechnologické informace (NCBI) pomocí nástroje BLASTn (nucleotide-nucleotide Basic Local Alignment Search Tool) byla prokázána shoda s Francisella tularensis subsp. holarctica kmen B-8364 chromosome (complete genome) a mnoha dalšími kmeny F. tularensis subsp. holarctica.

Tabulka 1. Souhrnná tabulka vyšetření vzorků klíšťat na přítomnost Francisella tularensis
Table 1. Summary table for the examination of ticks for Francisella tularensis

Vysvětlivky: D.r. – Dermacentor reticulatus; I.r. – Ixodes ricinus; H.c – Haemaphysalis concinna. Explanations: D.r. – Dermacentor reticulatus; I.r. – Ixodes ricinus; H.c – Haemaphysalis concinna.

Tabulka 2. Souhrnná tabulka vyšetření vzorků komárů a muchniček na přítomnost Francisella tularensis
Table 2. Summary table for the examination of mosquitoes and blackflies for Francisella tularensis

DISKUSE

Tato práce je nejrozsáhlejším molekulárním sreeningem různých skupin hematofágních členovců na přítomnost F. tularensis (porovnáno s dostupnou literaturou). Výzkum probíhal v několika lokalitách v okrese Břeclav v Jihomoravském kraji. Lokality pro sběr klíšťat byly vytipovány na základě dostupných epidemiologických dat poskytnutých Státním zdravotním ústavem, Krajskou hygienickou stanicí Jihomoravského kraje se sídlem v Brně a místními veterináři a infektology. Minimální prevalence F. tularensis (tj. jedno klíště v dané směsi je pozitivní) u klíšťat odchycených metodou vlajkování byla 0,02 % (1/4 270), prevalence u klíšťat odebraných z divoké zvěře byla 1,28 % (1/78), zatímco u ostatních zástupců hematofágních členovců (komáři a muchničky) nebyla F. tularensis prokázána. Námi zjištěné relativně nízké hodnoty prevalence jsou nižší jak v rámci České republiky, tak i v porovnání s jinými evropskými zeměmi. V důsledku nastavení velmi citlivé Real-time PCR, která je schopna detegovat dokonce 1 buňku F. tularensis ve vzorku je zřejmé, že volba směsných vzorků neovlivnila konečnou prevalenci

F. tularensis v daném souboru hematofágních členovců. S největší pravděpodobností došlo k vyšetřování vzorků v tzv. meziepidemickém období, kdy cirkulace patogenu v přírodním ohnisku nákazy je utlumena, což koresponduje i s incidencí u lidí v daném kalendářním roce (SZÚ). V roce 2022, kdy probíhal výzkum, byla incidence hlášených případů tularemie u lidí nízká a její hodnota 0,4 na 100 000 obyvatel pro ČR byla shodná s incidencí v Jihomoravském kraji. Ve třech letech 2019, 2020 a 2021, které předcházely studii, byla incidence v Jihomoravském kraji (2,9; 1,4 a 0,7 na 100 000 obyvatel), tedy vždy vyšší, než v roce výzkumu a pokaždé převyšovala incidenci celorepublikovou (1,0; 0,7 a 0,5/100 000 obyvatel) v jednotlivých letech. V roce 2023 incidence onemocnění tularemií v Jihomoravském kraji opět stoupla na 0,7 a v celé ČR na 0,5 na 100 000 obyvatel [Zdroj: ISIN, Informační systém infekční nemoci, Státní zdravotní ústav, Praha].

Jižní Morava, zejména oblast dolního toku řeky Dyje a Moravy při hranicích s Rakouskem a Slovenskem, je dlouhodobě (od roku 1936) známá jako oblast endemického výskytu tularemie [12, 13]. V bývalém Československu byla F. tularensis izolována v klíšťatech I. ricinus [14, 15, 16, 17], I. trianguliceps [18], Haemaphysalis concinna [19] a D. reticulatus [20], který je z dlouhodobého pohledu také nejvýznamnějším vektorem a současně rezervoárem agens [21]. Transstadiální přenos F. tularensis byl prokázán experimentálně u I. ricinus i D. reticulatus [15, 22, 23], a transovariální přenos byl popsán u D. reticulatus [13, 15]. Prevalence F. tularensis v klíšťatech D. reticulatus v Česku a na Slovensku se v minulých letech pohybovala v rozmezí jednotek procent (0–2,6 %) [20, 21, 24]. Podobné hodnoty prevalence byly zaznamenány i v okolních zemích jako jsou Bělorusko (0,9 %), Francie (1 %), Maďarsko (0 %), Portugalsko (8,9 %) a Španělsko (0,5 %) [25, 26, 27, 28, 29]. Vyšší prevalence byla naopak detekována při vyšetřování klíšťat I. ricinus v Srbsku (3,8 %) [30] a Německu (8,4 %) [31]. Obecně platí, že u prací, kde jsou uváděny vysoké hodnoty prevalence F. tularensis, je třeba vyloučit nespecifický záchyt tzv. ¢Francisella –like¢ endosymbiontů [9].

V severských zemích se na základě dostupných dat zvažuje také přenos F. tularensis infikovanými komáry [3, 32, 33]. F. tularensis byla prokázána v roce 2019 v odchycených komárech Aedes cinereus při sezonní epidemii v centrálním Švédsku [34]. Navíc některé švédské práce experimentálně potvrzují transstadiální přenos F. tularensis v komárech [33, 35, 36]. Finská studie z roku 2021 prokázala absenci F. tularensis v klíšťatech I. ricinus, na rozdíl od významné prevalence F. tularensis v komárech [37]. Naše studie z roku 1997, která probíhala v endemické oblasti výskytu tularemie na Břeclavsku, však nepotvrdila výskyt F. tularensis u komárů (bylo vyšetřeno celkem 9167 samic komárů Aedes spp.) [38]. Absenci F. tularensis v komárech potvrzuje i tato práce. Přenos F. tularensis komáry stejně jako muchničkami lze tedy v rámci střední Evropy považovat za spíše nepravděpodobný [39].