Diagnostika Clostridium difficile infekcí – porovnávací studie dvou imunoenzymatických metod s konfirmací pomocí PCR a kultivace s následnou ribotypizací kmene*

Overview

Cíl práce:
Porovnání senzitivity a specificity dvou komerčních testů na stanovení Clostridium difficile GDH (glutamát dehydrogenázy) a toxinů A/B.

Materiál a metodiky:
Bylo testováno 86 stolic pacientů hospitalizovaných ve FN Motol. GDH a toxiny A/B byly paralelně vyšetřovány dvěma testy: C. difficile Quik Chek Complete^®, Techlab,USA) a Liaison^® C. difficile GDH a Toxins AαB (DiaSorin USA). Současně byly ze stolic izolovány nukleové kyseliny pomocí UltraClean^® Fecal DNA (MoBio Laboratories, USA). Pro metodu PCR byla použita komerční souprava C. difficile Elite MGB^® kit (Nanogen, Itálie). Anaerobní kultivace na selektivním médiu pro C. difficile (Oxoid) proběhla u všech vzorků vykazující pozitivitu alespoň jednoho testu. Čisté izoláty byly molekulárně analyzovány ribotypizací.

Výsledky:
GDH a toxin A/B negativních oběma metodami bylo 36 vzorků (42 %). GDH a toxin pozitivních oběma metodami bylo 20 vzorků (23 %). GDH pozitivních a toxin negativních oběma metodami, ale PCR pozitivních bylo 9 vzorků (10 %). GDH pozitivních a toxin negativních oběma metodami a PCR negativních bylo 11 vzorků (13 %). GDH pozitivní, toxin pozitivní pouze testem Liaison^® bylo 6 vzorků (7 %). GDH pozitivní pouze Liaison^® byly 4 vzorky (5 %). K selhání kultivace došlo u 11 vzorků (13), z toho u 7 vzorků byl pozitivní test PCR. PCR reakce byla inhibována v 5 případech (6 %). Zachycené ribotypy toxigenní: AI-3, 001, 002, 012,014, 017, 020, 049, 054, 078, 176, 203, 413 a netoxigenní: AI-34, AI-61, 010, 485, 495, 596.

Závěr:
Stanovení toxinu A/B testem Liaison^® vykazuje u námi vyšetřeného souboru o 7 % vyšší senzitivitu. Dvoukrokové uspořádání testů také přináší ekonomickou úsporu, která může být využita např. k zavedení PCR metod do diagnostického algoritmu laboratoře.

Klíčová slova:
Clostridium difficile – ribotypizace – glutamát dehydrogenáza – toxiny A/B – Quik Chek Complete – Liaison

ÚVOD

Clostridium difficile je významným nozokomiálním patogenem současnosti [1, 2]. V České republice dochází k výraznému nárůstu incidence CDI (Clostridium difficile Infection), zejména v souvislosti s ribotypem 176 [3]. Včasná diagnostika CDI je klíčová k zavedení protiepidemických opatření k zábraně šíření infekce a adekvátní terapie pro pacienta [4]. Podle posledních britských doporučení pro diagnostiku a hlášení C. difficile, která vycházejí z testování 12 441 průjmových stolic, je diagnostiku CDI doporučeno provádět ve dvoustupňovém testovacím schématu, které se skládá z průkazu GDH imunoenzymaticky nebo NAAT (Nucleic Acid Amplification Test) či PCR (Polymerase Chain Reaction) a v druhém kroku použití senzitivního imunoenzymatického testu na průkaz toxinu nebo cytotoxický test [5]. Zavedení PCR metod do diagnostiky CDI je evropským trendem, ať jako metody screeningové nebo konfirmační. Tyto metody se vyznačují vysokou senzitivitou a specificitou a významně zkracují čas získání výsledku [6–13]. V naší práci jsme porovnávali senzitivitu a specificitu dvou komerčních metod (imunoenzymatická a imunoluminiscenční metoda) na stanovení antigenu GDH a toxinů A/B. U všech vzorků byl zároveň proveden průkaz DNA toxigenních C. difficile pomocí real-time PCR. Vzorky, které vykazovaly pozitivitu, alespoň jednoho testu, byly kultivovány v anaerobním boxu. Izoláty C. difficile byly dále analyzovány PCR ribotypizací založené na kapilární elektroforéze.

MATERIÁL A METODY

Materiál

Do testování bylo zařazeno 86 tekutých/neformovaných stolic od pacientů s podezřením na klostridiovou infekci hospitalizovaných ve Fakultní nemocnici Motol za období květen až červen 2013.

Metody

Detekce antigenu GDH a toxinu A/B

C. difficile Quik Chek Complete^® (Techlab, USA) je rychlý membránový imunoenzymatický test detekující GDH a toxiny A/B v jednom kroku [14–17].

Princip testu: Specifické protilátky (anti GDH, anti toxin A/B, anti peroxidáza) jsou imobilizovány ve třech liniích na membráně. Vzorek je přidán do ředícího roztoku obsahujícího konjugát (monoklonální protilátka specifická pro GDH a polyklonální protilátka specifická pro toxiny A/B, obě značené křenovou peroxidázou). Během 15minutové inkubace dochází k navázání antigenů ve vzorku na konjugát a migraci komplexů antigen-protilátka přes filtrační papír na membránu s imobilizovanými specifickými protilátkami. Po promytí je přidán substrát. Pokud došlo k navázání imunokomplexů antigen-konjugát na protilátku, dojde k zabarvení testovací linie.

Liaison^® C. difficile GDH test (DiaSorin, USA)

Je to automatizovaná chemiluminiscenční imunoanalýza sendvičového typu určená k detekci antigenu GDH na přístroji Liaison^®.

Princip testu: Vzorek je podle konzistence naředěn dilučním roztokem. Poté je přidán do extrakční zkumavky, vortexován a centrifugován. Během centrifugace dojde k oddělení pevných částí stolice od tekutiny, která je následně analyzována. Takto upravený vzorek je inkubován s paramagnetickými částicemi potaženými monoklonální protilátkou proti GDH a protilátku proti GDH konjugovanou s isoluminolem. Po inkubaci je nenavázaný materiál vymyt v promývacím kroku. Přidáním startovacího roztoku je započata chemiluminiscenční reakce. Světelný signál je v relativních světelných jednotkách (RLU) měřen fotonásobičem. Intenzita signálu je přímo úměrná ke koncentraci antigenu v kalibrátorech, kontrolách a vzorku.

Liaison^® C. difficile Toxins AαB test (DiaSorin, USA)

K provedení testu byl použit předpřipravený vzorek (ředění, extrakce) z testování přítomnosti GDH. Na paramagnetických částicích je navázána monoklonální protilátka proti toxinu A a polyklonální protilátka proti toxinu B. Konjugát obsahuje polyklonální protilátky proti toxinu A a B. V tomto testu je první inkubace s konjugátem a poté inkubace s paramagnetickými částicemi. Jinak se princip testu neliší. Oba testy byly provedeny v souladu s manuálem výrobce.

Detekce DNA toxigenních C. difficile pomocí PCR v reálném čase

DNA ze vzorků stolic byla izolována a purifikována pomocí soupravy UltraClean^® Fecal DNA (MoBio Laboratories, USA) podle manuálu výrobce. Interní kontrola amplifikace (součást amplifikační soupravy) byla přidána během izolace (po lyzačním kroku). PCR amplifikace byla provedena soupravou C. difficile Elite MGB^® kit (Nanogen, Itálie) v souladu s manuálem výrobce. Tato metoda je založená na triplexové amplifikační reakci v reálném čase a obsahuje specifické MGB proby pro detekci genů pro produkci toxinu A, B a interní kontroly.

Anaerobní kultivace

Vzorky stolic byly kultivovány podle standardního operačního postupu pro anaerobní kultivaci C. difficile FN v Motole. Před kultivací byl vzorek vystaven tzv. „alkoholovému šoku“, kdy je vzorek stolice smíchán v poměru 1 : 1 se 70% alkoholem, vortexován a inkubován 30–60 minut při laboratorní teplotě. Dvě kapky suspenze jsou inokulovány na selektivní agar pro C. difficile (Brazier, Oxoid) a anaerobně kultivovány při 35–37 °C, 48–72 hodin. Suspektní kolonie byly konfirmovány pomocí MALDI-ToF hmotnostní spektrometrie (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry) [18].

PCR ribotypizace

PCR ribotypizace následovala po extrakci DNA z  kolonie čistého izolátu pomocí chelexových kuliček [19]. PCR probíhala podle standardního operačního protokolu ECDIS-net (European Clostridium difficile infection surveillance network), který je dostupný po přihlášení na http://www.ecdisnet.eu/.

Toxigenita kmene

Toxigenita kmene C. difficile byla určena pomocí multiplexové PCR reakce se specifickými primery pro geny tcdA (toxin A), tcdB (toxin B), cdtA a cdtB, (binární toxin) [20]. Vizualizace amplifikovaných PCR produktů byla provedena elektroforeticky na agarózovém gelu s barvením GelRed.

VÝSLEDKY

Souhrnné výsledky jsou schematicky znázorněny na obrázku 1. Celkem bylo testováno 86 vzorků tekutých/neformovaných stolic od pacientů s podezřením na CDI hospitalizovaných ve FN Motol. GDH a toxin A/B negativních oběma metodami a PCR negativních bylo 36 vzorků (42 %). GDH a toxin pozitivních oběma metodami a PCR pozitivních bylo 20 vzorků (23 %). GDH pozitivních a toxin negativních oběma metodami, ale PCR pozitivních bylo 9 vzorků (10 %). GDH pozitivních a toxin negativních oběma metodami, ale PCR negativních bylo 11 vzorků (13 %). GDH pozitivní, toxin pozitivní a PCR pozitivních pouze Liaison^® bylo 6 vzorků (7 %). GDH pozitivní pouze Liaison^® byly 4 vzorky (5 %), z toho u 2 vzorků byla PCR pozitivita. K selhání kultivace došlo u 11 vzorků (13 %), z toho u 9 vzorků byl pozitivní test PCR. PCR reakce byla inhibována v 5 případech (6 %). Po opakované izolaci DNA ze stolice nedošlo k opakované inhibici PCR reakce. Zachycené ribotypy toxigenní: AI-3, 001, 002, 012,014, 017, 020, 049, 054, 078, 176, 203, 413 a netoxigenní: AI-34, AI-61, 010, 485, 495, 596.

DISKUSE

Výsledky naší srovnávací studie ukazují, že průkaz C. difficile toxinu A/B na přístroji Liaison^® vykazuje vyšší senzitivitu o 7 % ve srovnání s druhou testovanou metodou a test Liaison^® C. difficile GDH o 5 % oproti testu C. difficile Quik Chek Complete^®. Tento fakt si vysvětlujeme v rozdílném principu testu. Quik Chek Complete^® test je metodou imunoenzymatickou, kdy detekce probíhá na imobilizovaných protilátkách na membráně, zatímco testy Liaison^® C. difficile GDH a toxin A/B jsou metodami chemiluminiscenčními a protilátka je navázaná na paramagnetické kuličce, tudíž poskytuje větší povrch pro navázání případného antigenu. Výsledkem chemiluminiscenční reakce je světelný signál měřený fotonásobičem, citlivým detektorem schopným zachytit i slabé světelné signály. Intenzita signálu je přímo úměrná koncentraci analytu ve vzorku. U testu Quik Chek Complete^® je hodnocení testu prováděno vizuálně. Výhodu dvoukrokového testu firmy DiaSorin vidíme především v možné ekonomické úspoře u GDH negativních vzorků, vycházíme z vysoké ­negativní prediktivní hodnoty GDH. GDH negativní vzorky je možno interpretovat jako definitivně negativní na přítomnost C. difficile a není třeba testovat na přítomnost toxinů A/B.

V našem souboru vzorků se jednalo o 36 vzorků (42 %). Pozitivita GDH při negativitě toxinů A, B může znamenat přítomnost netoxigenního kmene C. difficile, ale nevylučuje ani přítomnost toxigenního kmene, kdy je třeba vycházet ze skutečnosti, že žádný z doposud užívaných imunochemických testů pro přímý průkaz toxinů A a B, nedosahuje zcela spolehlivou senzitivitu. Navíc se může vyskytnout zkřížená reaktivita testu GDH s jinými klostridii. Je proto vhodné a v klinické praxi často potřebné další doplňující vyšetření – v našem případě PCR cílené na průkaz genů kódujících produkci toxinů. K selhání kultivace u 11 vzorků došlo zřejmě z důvodů přechodně vzniklé nedostatečné anaerobiózy. Spektrum zachycených ribotypů z kultivovaných kmenů C. difficile odpovídá spektru ribotypů vyskytujících se v ČR. Vycházíme z výsledků PCR ribotypizace cca 200 kmenů v roce 2012. Implementaci molekulárních metod do diagnostiky CDI považujeme za přínosnou, zvláště jako metodu konfirmační u GDH pozitivních vzorků. Náklady na diagnostický set C. difficile Elite MGB^® dodávaný firmou Elisabeth Pharmacon jsou poloviční než u komerčních uzavřených systémů, nicméně je nutná předchozí izolace nukleových kyselin a s tím související vybavení a zaškolený personál laboratoře. Součástí každé testované série musí být přítomna pozitivní a negativní kontrola testu, proto je ekonomicky výhodnější testovat více vzorků najednou. Interní kontrola testu je součástí soupravy a přidává se během extrakce nukleových kyselin ze vzorku. Během našeho testování jsme zaznamenali inhibici PCR reakce v 5 případech. Bez přítomnosti interní kontroly v testu by byl vydán falešně negativní výsledek.

ZÁVĚR

Hledání optimální metody či spolehlivého algoritmu kombinujícího několik přístupů v laboratorní diagnostice CDI je stále předmětem odborných diskusí. Kromě toho se objevují stále nové komerční testy se snahou dosáhnout vysoké spolehlivosti. Diagnostické testy Liaison^® C. difficile GDH, toxin A/B, (Diasorin, USA) v našem sledování potvrdily vysokou senzitivitu. Implementace přímého průkazu DNA toxigenních C. difficile amplifikací nukleových kyselin nesporně přispívá k urychlení a zkvalitnění diagnostiky CDI jako doplňující nebo konfirmační metoda u GDH pozitivních, toxin negativních vzorků. Vyšší cena PCR vyšetření, může být do jisté míry kompenzována úsporou za neprovedená stanovení toxinů u GDH negativních vzorků. Rychlá a spolehlivá detekce C. difficile má kromě vlastního benefitu pro pacienta (omezení progrese infekce a rozvoje závažných komplikací, snížení počtu následných rekurencí) i významný epidemiologický aspekt spočívající v možnosti včasné prevence šíření C. difficile na další vnímavé jedince.

Podpora: Diagnostické soupravy byly dodány firmami DiaSorin, Elisabeth Pharmacon. Kultivace a PCR ribotypizace byly podpořeny granty: MZ ČR – RVO, FN v Motole 00064203 a MZ ČR IGA NT/14209–3.

Do redakce došlo dne 27. 11. 2013.

Adresa pro korespondenci:

Mgr. Marcela Krůtová

Ústav lékařské mikrobiologie

2. LF UK a FN v Motole

V Úvalu 84

150 06 Praha 5

e-mail: marcela.krutova@seznam.cz