Výskyt gramnegativních bakterií v prostředí transplantační jednotky Hemato-onkologické kliniky FN Olomouc

Overview

Studie s názvem „Surveillance of Infectious Complications in Hemato-Oncological Patients“ probíhala na oddělení 5C Hemato-onkologické kliniky FN Olomouc. Byla zahájena 1. července 2010 s dobou ukončení k 31. srpnu 2011. V tomto období bylo na oddělení hospitalizováno celkem 96 pacientů, z toho bylo 63 pacientů transplantovaných. V 43 případech se jednalo o transplantaci autologní, ve zbývajících případech o transplantaci alogenní. V uvedeném období bylo prováděno monitorování mikrobiální kontaminace prostředí u vybraných povrchů a ovzduší na výše uvedeném oddělení. Současně byla monitorována mikrobiální kontaminace aktuálně přítomného personálu (stěr pravé ruky a vlasů, výtěr z nosu). Z kultivačně prokázaných mikrobiálních agens, byly vybrány gramnegativní oportunně patogenní bakteriální kmeny.

Klíčová slova:
gramnegativní bakterie – imunosuprese – rezistence – biofilm

ÚVOD

Problematika gramnegativních bakterií jako původců nemocničních infekcí nabývá poslední dobou na významu. Zvláště u imunosuprimovaných pacientů, u nichž právě díky kompromitovanému imunitnímu systému mohou být tyto infekce velmi závažné až fatální. Dalším velmi významným faktorem je nutnost použití centrálních venózních katétrů u těchto pacientů, kdy hrozí zavlečení infekčního agens z povrchu kůže a zároveň zde hraje velmi významnou roli schopnost tvorby biofilmu. Z tohoto vyplývá nutnost neustálého monitorování jak prostředí, ve kterém se pacient nachází, tak i personálu, který pacienta ošetřuje. Infekce se podílejí na úmrtí pacientů po alogenní transplantaci kostní dřeně 17 %, respektive 21 % u autologních transplantací kostní dřeně [1].

Cílem studie bylo zjištění mikrobiální kontaminace prostředí a personálu na oddělení 5C Hemato-onkologické kliniky FN Olomouc pomocí pravidelného měsíčního monitorování. Toto oddělení je koncipováno jako reverzní izolace se 4 izolačními boxy pro pacienty po autologní, alogenní příbuzenské nebo nepříbuzenské transplantaci periferních kmenových buněk nebo kostní dřeně. Základní podmínkou zajištění stanovených parametrů boxů pro reverzní izolaci je fungující vzduchotechnika, která zajišťuje centrálně regulovaný přísun upraveného vzduchu. Popis stavebního rozložení oddělení 5C vychází z technické zprávy; oddělení je označeno jako JIP (4 izolační boxy pacientů a příslušející sociální zařízení) a vše ostatní včetně filtrů před jednotlivými pokoji je označeno jako zázemí JIP, které zahrnuje následující prostory: filtr u každého z pokojů, předsíň (filtr při vstupu na toto oddělení), čisticí místnost, sklad materiálu, kuchyňku, pokoj lékaře, chodbu a sesternu. Pokoje JIP odpovídají třídou čistoty superaseptickému operačnímu sálu, FED-STD-209E (USA) – 10 000. Na sociálním zařízení jednotlivých pokojů JIP je umístěna odsávací vyústka, výměna vzduchu je zajištěna odvodem 150 m³/h a je zajištěn podtlak vůči pokoji JIP a filtru u pokoje JIP. Místnosti zázemí JIP jsou považovány za čisté prostory s třídou čistoty FED-STD-209E (USA) – 100 000.

MATERIÁL A METODIKA

Šetření mikrobiální kontaminace ovzduší, povrchů a personálu na oddělení 5C probíhalo od srpna 2010 do července 2011 formou monitorování v měsíčních intervalech. Na každém odběrovém místě bylo v průběhu studie provedeno celkem 36 odběrů vzorků vnitřního vzduchu a na místě samém byla měřena teplota a relativní vlhkost vnitřního vzduchu přístrojem Testo 625 (GER). Zjišťování mikrobiální kontaminace vnitřního ovzduší bylo provedeno aktivním nasáváním pomocí aeroskopu MERCK-100 (GER). Odběry byly prováděny na krevní agar (Trios, spol. s r. o., CZE), následovala kultivace 48 hodin při 37 °C a kultivací prokázané kolonie byly sečteny. Podle nomogramu jejich konečné počty byly stanoveny pro m³ vnitřního ovzduší.

Kontrola mikrobiální kontaminace povrchů byla provedena stěry z plochy cca 10 x 10 cm sterilní výtěrovkou (CLASSIQSwabs^TM, Copan, ITA) smočenou ve sterilním fyziologickém roz­toku a následně vložené do zkumavky s 5 ml ­thioglykolátového bujonu (Trios spol. s r. o., CZE). Kultivace probíhala po dobu 48 hodin při 37 °C, následně bylo provedeno vyočkování na pevnou půdu (krevní agar a Endova půda) (Trios spol. s r. o., CZE) a prokázané bakteriální kmeny ve formě kolonií byly biochemicky identifikovány. U aktuálně přítomného personálu byly provedeny tři stěry (pravá ruka, vlasy a výtěr obou nosních dírek). Kultivace opět probíhala po dobu 48 hodin při 37 °C, následně bylo provedeno vyočkování na pevnou půdu (krevní agar a Endova půda) a prokázané bakteriální kmeny ve formě kolonií byly biochemicky identifikovány. Identifikace probíhala pomocí BD Phoenix^TM PID Panel na Phoenix Automated Microbiology System Instrument (USA). Pro stanovení citlivosti na antibiotika byl použit set pro stanovení minimálních inhibičních koncentrací (MIC) standardní mikrometodou v mikrotitrační destičce. Byla použita sestava antibiotik pro gramnegativní bakterie (I. a II. řada ATB) (Trios, spol. s r.o., CZE).

VÝSLEDKY

Mezi nejčastěji izolované gramnegativní bakteriální kmeny patřily Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Burkholderia cepacia a Klebsiella pneumoniae. Z dalších lze jmenovat např. Stenotrophomonas maltophilia, Klebsiella oxytoca, popř. Citrobacter freundii. Kompletní seznam izolovaných gramnegativních bakteriálních kmenů uvádějí obrázky 1–3.

Enterobacter aerogenes

Jedná se o gramnegativní tyčku, oxidáza negativní, kataláza pozitivní, citrát pozitivní, indol ne­gativní, patřící do čeledi Enterobacteriaceae. Enterobacter aerogenes je součástí běžné střevní flóry. U imunosuprimovaných pacientů může vyvolávat závažné bakteriální infekce, jako jsou pneumonie, močové infekce a sepse, zvláště ve spojitosti s centrálními venózními katétry [2]. Významnou vlastností je přirozená rezistence k různým antibio­tikům a schopnost tvorby biofilmu [3]. Během naší studie byl tento bakteriální kmen izolován celkem 22krát, přičemž u personálu 16krát a v prostředí 6krát. Na sociálním zařízení vedle pokoje pacienta byl E. aerogenes izolován ze stěru z žebrování elektrického přímotopu, z vnitřku lednice, telefonu u lůžka a výpusti sprchy. U personálu byl E. aerogenes izolován 10krát z nosní sliznice, 4krát z rukou a 2krát z vlasů.

Enterobacter cloacae

Jedná se o pohyblivou kataláza pozitivní, oxi­dáza negativní gramnegativní tyčku, patřící do čeledi Enterobacteriaceae. Běžně se vyskytuje v půdě a vodě. Je součástí střevní mikroflóry střevního traktu. Původce závažných nemocničních infekcí, nejčastěji močového a respiračního traktu [4]. Případná léčba infekcí vyvolaných tímto bakteriálním agens je komplikována přirozenou rezistencí na antibiotika a zároveň schopnost formovat biofilm [5]. Během naší studie byl tento bakteriální kmen izolován celkem 21krát, přičemž v prostředí to bylo 20krát. Na pokojích pacientů se jednalo 6krát o výpusť sprchy, 2krát o vodu v míse WC a jednou o roztok na zubní kartáček. V zázemí to byl stěr z nesterilních rukavic, výpusť umyvadla na sesterně, ve skladu materiálu a v personálním filtru. Na kuchyňce byl E. cloacae izolován 3krát ve výpusti umyvadla, 2krát v lednici personálu a jednou na houbičce na nádobí. U personálu byl izolován 1krát z nosní sliznice.

Pseudomonas aeruginosa

Je gramnegativní tyčka z čeledi Pseudomonadaceae. Běžně se vyskytuje ve vodě a půdě. Jakožto oportunní patogen je původcem nemocničních infekcí. Podmínkami vzniku onemocnění jsou poruchy fagocytózy, rozsáhlé popáleniny, maligní procesy (hlavně leukémie), podávání cytostatik, imunosupresiv, kortikoidů, dlouhodobé podávání antibiotik, které umožní osídlení rezistentními pseudomonádami, těžké operativní výkony, dlouhodobé zavedení cévních katétrů nebo močových katétrů, diabetes [6, 7, 8]. Závažná je infekce u nemocných s cystickou fibrózou, kdy dýchací cesty jsou kolonizovány mukoidními kmeny s vysokou produkcí proteolytických enzymů [9]. Nemocní umírají na pneumonii bez příznaků septikémie. Ohroženi jsou také novorozenci, zvláště nedonošení (enterokolitida, sepse a meningitida). Z povrchové kolonizace může vzniknout systémové onemocnění. Léčba je komplikována nejen přirozenou rezistencí na antibiotika, ale také významnou schopností tvorby biofilmu [10, 11]. Tento bakteriální kmen byl izolován pouze z prostředí, a to celkem 22krát. Na pokojích pacientů se jednalo 8krát o výpusť sprchy nebo umyvadla, stěr z povrchu křesla, lištový odtah vzduchu, stěr z žebrování elektrického přímotopu a vodu v míse WC. V zázemí se jednalo o výpusť dřezu na kuchyňce pro personál (2krát), výpusť umyvadla na sesterně (2krát), stěry z úklidového nářadí – mopy, stěrky (3krát), výpusť umyvadla ve skladu materiálu, stěr z povrchu telefonu a stěr z láhve na infuze uložené ve skříni. Tyto kmeny byly přirozeně rezistentní na AMP, AMS, AMC a cefalosporiny 1. a 2. generace. Byly však izolovány také multirezistentní kmeny, které byly ze všech testovaných antibiotik citlivé pouze na COL, OFL a CIP.

Pseudomonas putida

Je gramnegativní, aerobní, saprofytická, pohyblivá tyčka z čeledi Pseudomonadaceae, běžně se vyskytující v půdě a vodním prostředí. Kolonizuje rostliny, se kterými je v mutuálním vztahu. P. putida je psychrofilní a nemnoží se při teplotě lidského těla. Význam však spočívá v riziku kontaminace infuzních nebo jiných roztoků [12]. P. putida byla izolována u pacienta s chronickou sinusitidou, dále může vyvolávat např. konjunktivitidu nebo septikémie [13, 14]. Společně s P. aeruginosa byly popsány outbreaky infekcí na odděleních hematoonkologie [15]. P. putida byla izolována celkem 3krát z prostředí. Dvakrát se jednalo o vodu v míse WC na pokoji pacienta a jednou o výpusť umývadla v personálním filtru.

Pseudomonas stutzeri

Gramnegativní, pohyblivá, půdní tyčka z čeledi Pseudomonadaceae, vyskytující se jak v půdním, tak vodním prostředí. Vyskytuje se také v nemocničním prostředí, kde se může uplatňovat jako oportunní patogen, který byl poprvé zachycen jako původce bakteriémie, septikémie, meningitid, endokarditid, pneumonií a infekcí močového traktu [16, 17, 18, 19, 20]. Na rozdíl od P. aeruginosa bývá dobře citlivá na většinu antibiotik. Ovšem kmeny izolované od imunosuprimovaných pacientů byly stejně rezistentní jako kmeny P. aeruginosa [21]. Stejně jako P. aeruginosa má i tento bakteriální kmen schopnosti tvorby biofilmu. Během naší studie byla P. stutzeri izolována 1krát ve výpusti umyvadla čistící místnosti.

Pseudomonas mendocina

Pseudomonas mendocina je gramnegativní, nefermentující tyčka z čeledi Pseudomonadaceae. Poprvé byla izolována v roce 1970 z půdy a vody. Tento environmentální bakteriální kmen je vzácně popisován jako lidský patogen. Byly však popsány případy, kdy byla P. mendocina označena jako původce sepsí a endokarditid [22, 23, 24]. Během našeho šetření byla izolována jednou z rukou osoby ošetřujícího personálu.

Escherichia coli

Jedná se o gramnegativní, fakultativně an­aerobní, pohyblivou tyčku, řadící se do čeledi Enterobacteriaceae. Je součástí běžné střevní flóry člověka a slouží jako nejběžnější indikátor fekální kontaminace pitné vody. E. coli je popisována jako původce průjmových onemocnění hlavně u novorozenců, ale také nemocničních infekcí, nejčastěji bakteriémií, infekcí močových cest a pneumonií [25, 26, 27]. U těchto extraintestinálních infekcí je zdrojem bakterií tlusté střevo. Problémem při léčbě je však narůstající rezistence vůči antibiotikům a schopnost formování biofilmy. Během našeho šetření byla E. coli izolována celkem 9krát, přičemž 6krát z prostředí a 3krát od ošetřujícího personálu. V případě prostředí se jednalo 3krát o vodu v míse WC na pokoji pacien­ta, výpusť umyvadla na pokoji pacienta, stěr z nesterilních rukavic a stěr z vnitřku lednice na pokoji pacienta. U personálu byla E. coli 3krát izolována z nosní sliznice.

Klebsiella pneumoniae

Je gramnegativní, nepohyblivá, fakultativně anaerobní tyčka. Je součástí běžné flóry v ústech a trávicím traktu. Řadí se do čeledi Enterobacteriaceae. Přirozeně se vyskytuje v půdě. Typicky vyvolává pneumonie a infekce močových cest, a to jak v komunitním, tak nemocničním prostředí [28]. Zároveň se uplatňuje jako původce bakteriémií, a to hlavně u imunosuprimovaných pacientů. Mezi nejrizikovější faktory pro akvírování K. pneumoniae a rozvoj infekce byla označena transplantace orgánů, dialýza a onkologická onemocnění [29]. Velmi závažných problémem se jeví narůstající rezistence na antibiotika a také tvorba biofilmu. Během naší studie byla K. pneu­moniae izolována 4krát z prostředí. Jednalo se 2krát o výpusť sprchy a vodu v míse WC na pokoji pacienta a výpusť dřezu na kuchyňce personálu.

Klebsiella oxytoca

Jedná o gramnegativní, nepohyblivou tyčku. Po K. pneumoniae jde o druhý nejvýznamnější klinický kmen rodu Klebsiella. Byla popsána jako původce bakteriémií, septických stavů, zvláště u imunosuprimovaných pacientů [30]. Problémem je i v tomto případě narůstající rezistence na antibiotika [31]. K. oxytoca byla v našem případě izolována pouze jednou, a to z povrchu láhve na glukózu uloženou ve skříni.

Burkholderia cepacia

Jedná se o nefermentující gramnegativní bakterii, patřící do čeledi Bukrholderiaceae. Vyskytuje se ve vodě, v půdě a na rostlinách. B. cepacia je spojována s nemocničními infekcemi dýchacích cest, zvláště u pacientů s cystickou fibrózou, ale nejenom s ní [32]. Je přirozeně rezistentní k aminoglykosidům, kolistinu a také běžným dezinfekčním prostředkům [33]. Dalším problémem je schopnost tvorby biofilmu. Během našeho šetření byla B. cepacia izolována celkem 4krát z prostředí. Jednalo se o výpusť sprchy a umyvadla na pokoji pacienta, stěr z vnitřku lednice lékařů a z košíku na přípravu injekcí na sesterně. Tento kmen, kromě přirozených rezistencí na AMP, AMS, AMC, kolistin a cefalosporiny 1. a 2. generace, vykazoval značnou rezistenci na fluorochinolony.

DISKUSE

Všechny námi izolované gramnegativní bakteriální kmeny představují pro imunosuprimované pacienty riziko vzniku infekcí s možnými závažnými až fatálními následky [34].

Jelikož jsme v ovzduší žádnou gramnegativní bakterii neprokázali (všechna šetření byla bez přítomných gramnegativních bakterií), lze předpokládat, že tyto bakterie izolované z vlasů personálu, jsou kontaminací pocházející z rukou. Dále je nutné počítat s tím, že pseudomonády jsou odolné vůči dezinfekčním prostředkům na bázi kvarterních amoniových solí, ve kterých se mohou dokonce i množit [12]. Všichni námi izolovaní zástupci z čeledi Pseudomonaceae jsou v literatuře popsáni jako schopni tvořit biofilmu. Schopnost formovat biofilmu je velmi závažným problémem, a to jak v souvislosti se zavedenými centrálními venózními katétry, tak i s jejich nálezem v prostředí, jako jsou výpusti umyvadel a sprch. Zvyšuje rezistenci jednotlivých bakterií vůči antibiotikům a dezinfekčním prostředkům [10, 11, 35]. V této souvislosti je naprosto nezbytná ne jenom důkladná chemická dekontaminace, ale i mechanická očista, která je jako jediná skutečně účinná proti tvorbě biofilmy. S tím však souběžně souvisí i náležitá antibiotická terapie pacientů, správná implementace sterilizačních metod a dodržování postupů pro kontrolu a prevenci vzniku infekcí. Prostředí těchto oddělení je specifické svým obrovským selekčním tlakem na veškeré mikroorganismy, ať už je způsoben antibiotiky nebo dezinfekčními prostředky. Během studie byly popsány kmeny jednak dobře citlivé na antibiotika, ale i kmeny multirezistentní (např. Pseudomonas aueruginosa, Burkholderia cepacia, Enterobacter cloacae). Jelikož většinou byly tyto kmeny izolovány z vlhkého prostředí, jako např. výpusti sprch a umyvadel, lze předpokládat, že ve zvýšené rezistenci na antibiotika se zde výrazně uplatňuje právě role tvorby biofilmu. Zajímavostí je, že téměř všechny izolované bakteriální kmeny, byly rezistentní na tetracyklin. Obecně lze říci, že kmeny izolovány z prostředí z povrchů, byly více citlivé, než kmeny izolované v místech typu výpusti sprch, umyvadel atd. Za tímto zjištěním může právě schopnost formovat biofilm.

ZÁVĚR

Studie, v souladu se současnými literárními údaji, potvrdila na oddělení 5C Hemato-onkologické kliniky FN Olomouc promořenost personálu a výskyt v prostředí gramnegativních kmenů, přičemž tyto mají schopnost tvorby biofilmu. Tyto kmeny jsou považovány za významné oportunní patogeny, které u imunosuprimovaných pacientů mohou vyvolat život ohrožující infekce, které mohou mít až fatální následky.

Seznam zkratek

AMC – amoxicillin + kyselina klavulanová

AMP – ampicilin

AMS – ampicilin + sulbactam

CIP – ciprofloxacin

COL – kolistin

OFL – ofloxacin

Práce byla podpořena grantovým projektem Research Support Foundation, Vaduz - Surveillance of Infectious Complications in Hemato-Oncological Patients [801100021/39].

Do redakce došlo dne 29. 6. 2012.

Kontaktní adresa:

Mgr. Ondřej Holý

Ústav preventivního lékařství

Lékařská fakulta Univerzity Palackého v Olomouci

Hněvotínská 3

77515 Olomouc

e-mail: holy.ondrej@seznam.cz