Využití testů avidity IgG protilátek v diagnostice cytomegalovirové infekce

Lidský cytomegalovirus (CMV) je nejčastějším etiologickým agens způsobujícím kongenitální infekce. Primoinfekce CMV může vést k těžkému onemocnění a komplikacím také u pacientů, u nichž probíhá imunosupresivní terapie nebo onemocnění charakterizované imunosupresí. Základní možností rozlišit primoinfekci od reaktivace latentní infekce nebo reinfekce je stanovení avidity IgG protilátek. Cílem naší práce bylo stanovení indexu avidity CMV IgG metodikou ELISA s denaturací vazby IgG protilátek na antigen a metodou CMIA (chemiluminiscentní imunoesej na mikropartikulích) na analyzátoru Architect, Abbott.

Všechny testované metody prokázaly ve stanovení avidity CMV IgG srovnatelnou shodu. Test firmy Abbott vykázal v některých případech lepší reflexi vyzrávání IgG protilátek v průběhu primoinfekce než metoda chemická používající rozrušení vazby antigenu a protilátky denaturačním činidlem na mikrodestičkách.

Klíčová slova:
cytomegalovirus (CMV) – IgG protilátky – avidita – primoinfekce

Úvod

Lidský CMV je nejčastějším etiologickým agens způsobujícím kongenitální infekce (0,2–2,5 % v rozvinutých zemích). Nejčastější formou je asymptomatická infekce (90 % případů). Klinická manifestace zahrnuje těžké poškození plodu až úmrtí plodu v nejtěžších případech, kdy k onemocnění dochází v prvním trimestru těhotenství. Typickými symptomy jsou poškození centrálního nervového systému (CNS) plodu, hepatosplenomegalie, hemolytická anémie, hyperbilirubinémie, trombocytopénie, pneumonie, poškození sluchu – vrozená hluchota. U 10–15 % dětí, které jsou po porodu asymptomatické, se mohou vyvinout pozdní následky po několika měsících i letech, a to zvláště poruchy sluchu, mentální retardace nebo poruchy chování [1, 4, 6, 20, 21].

Incidence primární infekce u těhotných žen je udávána mezi 0,5–4 %. K sérokonverzi během těhotenství dochází u 0,4–2 % těhotných, podle séroprevalence v populaci (35–95 %) [22]. Riziko kongenitální infekce je mnohem vyšší během primoinfekce těhotné ženy, kdy je riziko přenosu infekce z matky na plod 30–40%, oproti riziku přenosu infekce během reaktivace nebo reinfekce (0,15–2,2 %), kdy se většina kongenitálně infikovaných dětí rodí asymptomatických [8]. U těhotné ženy je obtížné diagnostikovat primoinfekci CMV, zejména pokud nemá výrazné klinické příznaky, protože screeningové sérologické testování těhotných žen se neprovádí. Lékař, indikující toto vyšetření, musí mít na cytomegalovirový původ onemocnění podezření [8, 10, 16, 17].

CMV způsobuje těžké komplikace i u pacientů s nádorovým onemocněním, po transplantacích orgánů a tkání, u HIV+ pacientů i nemocných s imunosupresivní terapií. CMV infekce u imunosuprimovaných pacientů probíhá dlouhodobě, má značnou mortalitu. Zejména při primoinfekci dochází k těžkým klinickým projevům.

Přítomnost specifických IgG protilátek s nízkou aviditou je výrazem probíhající primoinfekce nebo infekce prodělané v nedávné době několika týdnů až měsíců. Přítomnost specifických IgG protilátek s vysokou aviditou primoinfekci vylučuje. Fyzikální vazba mezi jednotlivým vazebným místem na protilátce a specifickým antigenním epitopem je nazývána vazebnou afinitou protilátky. Čím vyšší je afinita, tím pevnější je spojení protilátky a antigenu, a tím pravděpodobněji zůstane antigen navázán na vazebné místo protilátky. Afinita protilátky stoupá s opakovanou expozicí antigenu. B lymfocyty upravují vazebné místo BcR receptoru v přítomnosti antigenu procesem tzv. „somatické mutace“. Vznikají tak klony B lymfocytů s vyšší afinitou k antigenu, které se dále diferencují na plazmatické buňky, které produkují specifické protilátky charakteristické vysokou afinitou k danému antigenu. Avidita je funkcí afinity molekul multivalentní protilátky vázané na multivalentní antigen a upevňuje se opakovanou vazbou na identické epitopy antigenu. Čím více má molekula protilátky vazebných míst pro antigen, tím vyšší je její avidita. Vazba dvou různých molekul protilátky na týž antigen, což je běžné u patogenů s mnoha stejnými epitopy, umožňuje aktivaci B lymfocytů i komplementu. Opakovaná infekce nebo reaktivace vede k rychlé produkci IgG protilátek s vysokou afinitou k danému antigenu, protože jsou tvořeny po expanzi paměťových buněk [9, 12].

Cílem naší práce bylo stanovení indexu avidity mikrodestičkovou metodou ELISA pomocí denaturace vazby nízkoavidních CMV IgG protilátek na antigen roztokem močoviny, a to 3 různými mikrodestičkovými testy ELISA (Radim, Itálie; Test Line, ČR; Vidia, ČR). Výsledky byly porovnávány se stanovením avidity CMV IgG metodou CMIA (chemiluminiscentní imunoesej na mikropartikulích) na analyzátoru Architect, i2000, Abbott [7].

Materiál a metody

Stanovení avidity CMV IgG je možné klasickou nepřímou metodou, která je založena na vazbě IgG protilátek na antigen na pevné fázi. Denaturační činidlo, roztok močoviny, naruší vazbu protilátek s nízkou aviditou na antigen, navázaný na pevnou fázi, tj. na povrch jamky mikrotitrační destičky. Avidita je stanovena v procentech IgG, která zůstala navázána na antigen po inkubaci s močovinou proti procentu IgG, které bylo prokázáno při normální inkubaci, tzv. indexem avidity. U většiny testů založených na tomto principu znamená index avidity nižší než 40% primoinfekci před méně než 18 týdny, index avidity ve střední hladině (40–60 %), znamená neurčitou hraniční aviditu, a vyšší než 60 % znamená aviditu vysokou, kdy k primoinfekci došlo před dobou delší než 18 týdnů [11, 14, 15]. V naší studii jsme použili následující soupravy ELISA: I. Radim, Itálie; II. Test Line, ČR; III. Vidia, ČR.

Firma Abbott vyvinula pro analyzátor Architect i2000 aviditní test postavený na principu kompetice, kdy jsou z vyšetřovaného séra specifické protilátky proti CMV ve třídě IgG s nízkou aviditou prokazovány přímo pomocí vychytávání protilátek s vysokou aviditou vazbou na antigen, kterým je virový lyzát CMV AD 169, přítomný v tzv. blokovacím roztoku (1. krok). Zbylé CMV IgG protilátky s nízkou aviditou jsou prokazovány po vazbě na antigen navázaný na paramagnetických partikulích (2. krok). Výpočet indexu avidity je stanoven porovnáním avidity IgG v obou reakcích. U tohoto testu index avidity menší než 50% značí nízkou aviditu, k primoinfekci CMV došlo před méně než 18 týdny. Index avidity 50–60% je hraniční, průkaz protilátek s indexem avidity více než 60% znamená latentní infekci a primoinfekci prodělanou před více než 18 týdny [2, 13, 18].

Vyšetřili jsme dvě skupiny sér. První čítala 25 sér od 25 pacientů. Jednalo se o jednorázové odběry od 10 dětí a 15 imunokompetentních dospělých, 12 mužů, 13 žen, věk 0–87 let. Mezi vyšetřenými bylo 5 novorozenců, 5 dětí do 15 let věku, 7 těhotných nebo matek novorozenců (věk 25–40 let) a 8 dospělých (20–87 let). Nejčastějšími diagnózami dětí i dospělých byly mononukleóza, trombocytopénie, lymfadenopatie, angína, dyspepsie.

Druhá skupina čítala 38 sér od 12 pacientů (10 z nich mělo imunosupresivní terapii po transplantaci ledviny, 2 byli imunokompetentní). V této skupině vyšetřených (7 mužů, 5 žen; věk 1 rok až 60 let) jsme porovnávali index avidity v jednoměsíčních časových intervalech, ve kterých byla séra od jednotlivých pacientů odebrána.

Výsledky

První skupina vyšetřených sér z jednorázových odběrů vykázala následující výsledky, které jsou prezentovány v tabulce 2.

U všech 5 novorozenců jsme oběma typy metod stanovili vysokou aviditu, u některých testů byly výsledky v šedé zóně, jednalo se tedy o přenesené mateřské protilátky. Primoinfekce CMV u novorozenců ani kongenitální infekce prokázána nebyla. Ve skupině 5 dětí do 15 let jsme u 4 dětí, shodně ve všech testech, prokázali vysokou aviditu, a tedy infekci CMV staršího data. U 2letého chlapce s diagnózou angína jsme neshodně prokázali primoinfekci CMV, index avidity 39% metodou CMIA, zatímco všemi 3 mikrodestičkovými metodami ELISA vysokou aviditu CMV IgG 78–79%. U 7 těhotných žen nebo matek novorozenců jsme v 6 případech prokázali IgG s vysokou aviditou 72–94%. U 1 matky novorozence jsme v mikrodestičkových metodách ELISA s denaturačním činidlem prokázali v jednom testu vysokou aviditu, ve zbylých 2 aviditu ve střední hladině. Kompetitivní metodou CMIA na analyzátoru Architect jsme stanovili aviditu nízkou, 21%, která by svědčila pro primoinfekci matky. Klinická diagnóza byla B258, cytomegalovirová nemoc. Bohužel jsme neměli dostatek séra od novorozence, abychom jej mohli vyšetřit stejným způsobem všemi metodami. Z 8 vyšetřených dospělých jsme prokázali ve 4 případech shodně nízkou aviditu, která značila primoinfekci CMV. Jednalo se o následující klinické obrazy: mononukleóza, nemoci slinných žláz, horečka, infekce CNS. Ze zbývajících 4 pacientů jsme ve 2 případech určili vysokou aviditu všemi testy. V jednom případě jsme prokázali vysokou aviditu metodou CMIA (94%) i 2 mikrodestičkovými metodami (89 a 92%), zatímco v jednom mikrodestičkovém testu byla stanovena avidita nízká, 28%. Protože se jednalo o pacientku ve věku 86 let, je latentní infekce pravděpodobnější. U 20leté ženy metoda CMIA zjistila nízkou aviditu 24%, 2 mikrodestičkové testy aviditu ve střední hladině 46% a 49% a 1 mikrodestičkový test stanovil vysokou aviditu 71%.

Druhá skupina 12 pacientů, která zahrnovala 38 sér odebraných od jednotlivých pacientů v časových intervalech přibližně jednoměsíčních, nám dovolila sledovat dynamiku vyzrávání avidity CMV IgG protilátek – tabulka 3.

Průkaz primoinfekce se potvrdil u 5 pacientů, u nichž byly v prvních odběrech prokázány IgG protilátky s nízkou aviditou. U 1 pacienta jsme prokázali kompetitivním testem avidity firmy Abbott sérokonverzi v IgG protilátkách, když první odběr byl negativní, a diagnostikovali tak začátek primoinfekce CMV. V tomto případě ve shodě s jedním mikrodestičkovým testem. U dalšího pacienta byla hladina CMV IgG velmi vysoká, vyšší než 2500 AU/ml, analyzátor Architect v tomto případě aviditu nestanoví. V mikrodestičkových testech používajících denaturační metodu byly u tohoto pacienta shodně prokázány IgG protilátky s vysokou aviditou, což potvrdilo, i vzhledem k výši jejich hladiny, booster při aktivaci latentní infekce. U 4 vyšetřených pacientů jsme shodně všemi testy prokázali vysokou aviditu CMV IgG ve všech vzorcích.

Kompetitivní metoda stanovení avidity CMV IgG vyvinutá firmou Abbott ve 3 z 5 prokázaných případů primoinfekce CMV názorně ukázala vyzrávání IgG protilátek postupným zvyšováním jejich avidity, což je dokumentováno v tabulce 3. U pacienta č. 3 bylo naopak vyzrávání avidity CMV IgG lépe prezentováno u mikrodestičkových testů.

Rozdílné výsledky jsme v této skupině pacientů zjistili ve 2 případech. Jednalo se o pacientku č. 2, matku po porodu, která shodně ve 2 mikrodestičkových testech vykázala nízkou aviditu svědčící pro primoinfekci CMV, zatímco třetí test ELISA stanovil aviditu ve střední hladině a test CMIA na analyzátoru Architect vykázal aviditu vysokou. V tomto případě je nutné k rozhodnutí použít další testy. Naopak u pacienta č. 6 byla metodou CMIA určena avidita nízká, zatímco 2 mikrodestičkovými testy vysoká a třetím ve střední hladině. Také v tomto případě bude nutné nález dále konfirmovat.

Diskuse

Všechny testované metody prokázaly ve stanovení avidity CMV IgG srovnatelné výsledky. Neshody ve výsledcích mezi mikrodestičkovými metodami a metodou CMIA na analyzátoru Architect, Abbott by měly být dořešeny konfirmačním vyšetřením metodou western blot, dalším kontrolním odběrem v přiměřeném časovém intervalu a vyšetřením dalších markerů infekce. Při podezření na primoinfekci CMV u těhotné ženy musí následovat další vyšetření, a to virémie a průkaz CMV DNA v plodové vodě [3, 17]. V případě primoinfekce u imunosuprimovaného nemocného je to rovněž vyšetření virémie a přímý průkaz CMV DNA z materiálu odpovídajícího klinickému obrazu pacienta.

Výhodou testů Abbott je jejich plně automatizované provedení. Je rovněž možné nainstalovat program algoritmu vyšetření CMV IgG, CMV IgM i avidity CMV IgG. [19]. Výhodou je provedení všech uvedených vyšetření stejným typem testu v jednom běhu, což je umožněno jak metodikou CMIA na analyzátoru Architect, tak u výše uvedených mikrodestičkových testů ELISA. Test firmy Abbott vykázal v některých případech lepší reflexi v postupném vyzrávání IgG protilátek v průběhu primoinfekce CMV, ale v dalším prezentovaném případu bylo postupné zvyšování avidity dokumentováno i metodami chemickými používajícími rozrušení vazby antigenu a protilátky denaturačním činidlem na mikrodestičkách. Nevýhodou metodiky průkazu avidity na analyzátoru Architect oproti mikrodestičkovým je poměrně vyšší spotřeba vyšetřovaného séra.

Závěr

Uvedením nové metodiky CMIA na analyzátoru Architect, Abbott pro stanovení avidity CMV IgG se rozšířila možnost testování avidity CMV IgG. Po klasické chemické metodě, využívající pro stanovení avidity IgG protilátek na mikrodestičkách rozrušení vazby antigenu a protilátky denaturačním činidlem a následnou detekci metodou ELISA, je k dispozici automatizovaný test vyvinutý na principu kompetice vysoko a nízkoavidních IgG protilátek. Průkaz nízké avidity IgG protilátek má zásadní význam pro diagnostiku primoinfekce CMV a v některých zemích je toto vyšetření již součástí diagnostických postupů CMV infekce u těhotných žen i u ostatních nemocných [15, 17].

Poděkování: Děkuji laborantkám, slečně Šárce Čupajové a paní Gabriele Provazníkové, za spolupráci při sběru vhodných sér a při provedení všech uvedených testů. Děkuji prof. RNDr. Janu Krejskovi, CSc., za konzultace a cenné rady při přípravě tohoto článku.

Adresa pro korespondenci:

Prim. MUDr. Vlasta Štěpánová, Ph.D.
ÚKM FN
Sokolská 581
500 05 Hradec Králové
e-mail: stepanova@fnhk.cz