Pseudomonas aeruginosa, její rezistence k vybraným antibiotikům a tvorba biofilmu u kmenů izolovaných od pacientů s infekcí močových cest

Pomocí diskového difuzního testu jsme vyšetřili citlivost kmenů Pseudomonas aeruginosa k ofloxacinu, ciprofloxacinu, gentamicinu, amikacinu, kolistinu, imipenemu, meropenemu, piperacilinu s tazobaktamem a ceftazidimu. Tyto kmeny byly izolovány z močí pacientů s diagnózou infekce urogenitálního traktu, pocházely od ambulantních i lůžkových pacientů Fakultní nemocnice u svaté Anny. Dále byla u všech kmenů zjišťována tvorba biofilmu pomocí modifikované Christensenovy metody.

Celkem bylo vyšetřeno 118 kmenů. K ofloxacinu bylo rezistentních 88 (74,6 %) kmenů, k ciprofloxacinu 86 (72,9 %) kmenů a ke gentamicinu 70 (59,3 %) sledovaných kmenů. K imipenemu bylo rezistentních 40 kmenů (33,9 %), k meropenemu 42 kmenů (35,6 %), k amikacinu 14 kmenů (11,9 %), ke kolistinu 2 kmeny (1,7 %), k piperacilinu s tazobaktamem 35 kmenů (29,7 %) a k ceftazidimu 41 kmenů (34,7 %).

Současnou rezistenci k ofloxacinu, ciprofloxacinu a gentamicinu vykazovalo celkem 67 (56,8 %) kmenů, 12 (10,2 %) kmenů bylo rezistentních k většině testovaných antibiotik s výjimkou amikacinu a kolistinu.

Biofilm tvořilo celkem 41 kmenů (34,7 %), 23 kmenů pocházelo od 46 pacientů z lůžkových oddělení, kmeny pocházející od 72 ambulantních pacientů tvořily biofilm v 18 případech. Z 12 polyrezistentních kmenů tvořilo 8 biofilm (66,6 %).

Klíčová slova:
P. aeruginosa – fluorochinolony – gentamicin - infekce močových cest - biofilm.

Pseudomonas aeruginosa je gramnegativní bakterie, která se v posledních desetiletích stala jedním z nejzávažnějších původců nozokomiálních infekcí [11]. Jako patogen působí hlavně u osob s těžkým základním onemocněním, u pacientů s těžkými popáleninami a u imunosuprimovaných. Až donedávna byla dobře citlivá k chinolonům, protipseudomonádovým penicilinům, karbapenemům, aminoglykosidům i cefalosporinům III. a IV. generace. Bohužel v posledních letech došlo k obrovskému vzestupu rezistence k různým antibiotikům. Na tom se podílí nejen selekční tlak antibiotik různých skupin, ale pravděpodobně i zdravotnický personál a faktory prostředí. Často se jedná o mnohočetnou rezistenci, která je kódována na plasmidech a je přejímána od jiných mikrobů. V poslední době vzrostla rezistence k chinolonům [11], které jsou frekventně používány v léčbě močových infekcí u ambulantních pacientů. Rezistence k těmto látkám tak má obrovský dopad na morbiditu a mortalitu, což se projeví zejména zvýšenými náklady na léčbu takto postižených pacientů.

Jedním z faktorů virulence pseudomonád je schopnost tvorby biofilmu [14]. Biofilm je obvykle tvořen bakteriemi nebo kvasinkami, usazenými na pevném povrchu, které produkují polysacharidovou hmotu zvanou matrix, v níž drží buňky pohromadě [12]. V případě pseudomonád je polysacharid tvořen alginátem [6]. Mikroorganismy v biofilmu jsou lépe chráněny před různými zevními vlivy, jako jsou antibiotika a dezinfekční prostředky [3, 6, 12]. Poměrně často se biofilm tvoří v nekrotických tkáních, ve žlučových cestách, při zánětu prostaty a jeho eradikace je mnohdy obtížná [8, 12]. Pseudomonádový biofilm je často přítomen u cystické fibrózy, kde jsou pseudomonády nejčastější příčinou pneumonie [3, 6]. Výrazná je také afinita psedomonád k povrchu tzv. biomateriálů (t.j. rozmanitých cévek, močových katétrů apod.) vyrobených z polymerů [12, 13]. Poměrně často je nalézána tvorba biofilmu u kmenů izolovaných z močového ústrojí [6].

Cílem naší práce bylo zjistit aktuální citlivost močových kmenů P. aeruginosa z naší spádové oblasti k chinolonům, aminoglykosidům, karbapenemům, kolistinu, piperacilinu s tazobaktamem a ceftazidimu a zároveň zjistit, jaká je jejich schopnost produkovat biofilm.

Materiál a metody

V období od 9/2007 do 3/2008 jsme sledovali kmeny P. aeruginosa a jejich citlivost k ofloxacinu, ciprofloxacinu, gentamicinu, amikacinu, imipenemu, meropenemu, kolistinu, piperacilinu s tazobaktamem a ceftazidimu. Bylo získáno 118 kmenů z močí pacientů s diagnózou močové infekce. Kmeny byly sbírány od ambulantních (72 kmenů) i lůžkových pacientů (46 kmenů) Fakultní nemocnice u sv. Anny. Pouze 16 vzorků (13,6 %) pocházelo od žen. Věkový průměr testovaných pacientů činil 69 let.

Určení citlivosti kmenů k antibiotikům bylo provedeno pomocí diskového difuzního testu na MH-agaru. Byly použity antibiotické disky firmy Oxoid.

Tvorba biofilmu byla zjišťována v malých 3,0ml polystyrénových zkumavkách (Dispolab, Česká republika) [4]. Byla použita 24hodinová kultura vzorků v 1,5 ml tryptózosójového bujónu při 37 °C. Po trojím promytí vodou byla provedena detekce buněk adherovaných ke zkumavce pomocí 0,71% krystalové violeti. Jako biofilmpozitivní byly označeny ty kmeny, u kterých se po obarvení objevil viditelný film pokrývající stěny zkumavky [1, 2].

Výsledky

K ofloxacinu bylo rezistentních až 88 kmenů (74,6 %), k ciprofloxacinu 86 (72,9 %), ke gentamicinu 70 kmenů (59,3 %). Naproti tomu k amikacinu bylo rezistentních jen 14 kmenů (11,9 %), ke kolistinu pouze 2 kmeny (1,7 %). K imipenemu bylo rezistentních 40 kmenů (33,9 %), k meropenemu 42 kmenů (35,6 %), k ceftazidimu 41 kmenů (34,7 %) a k piperacilinu s tazobaktamem pak 35 kmenů (29,7 %) (graf 1).

U 67 kmenů (56,8 %) byla zaznamenána současná rezistence k ofloxacinu, ciprofloxacinu a gentamicinu. Celkem 12 kmenů vykazovalo citlivost pouze ke kolistinu a amikacinu (10,2 %), 6 z těchto kmenů pocházelo od hospitalizovaných osob se zavedeným močovým katétrem. Celkem bylo vyšetřeno 8 pacientů se zavedeným močovým katétrem.

Biofilm bylo schopno tvořit 41 kmenů (34,7 %). Dvacet tři kmenů pocházelo od 46 pacientů z lůžkových oddělení (50,0 %), 18 kmenů pocházelo od 72 ambulantních pacientů (25,0 %). Z 12 polyrezistentních kmenů tvořilo biofilm 8 kmenů (66,6 %).

Diskuse

Procento rezistence k testovaným chinolonům je alarmující. Ciprofloxacin, který se vyrábí i v tabletové formě a pokládá se za perorální lék volby při léčbě ambulantních pacientů, proto není možné kvůli rezistenci podat. Pokud mají ambulantní pacienti klinicky i laboratorně prokázanou infekci močových cest, pak při ověřené rezistenci k fluorochinolonům mohou být v současné době léčeni jen parenterálními preparáty (karbapenemy, protipseudomonádovými peniciliny). Tato léčba je nejen ekonomicky náročná, ale přináší pacientovi diskomfort výhledem k nezbytné hospitalizaci.

Přestože se gentamicin vzhledem ke své toxicitě a injekčním formám aplikace používá omezeně, je procento rezistentních kmenů značné, daleko vyšší než u testovaného amikacinu.

Rezistence kmenů k cefalosporinům a protipseudomonádovým penicilinům může být způsobena přítomností rozličných β-laktamáz, rezistence ke karbapenemům pak např. produkcí metalo-β-laktamáz. Ve 12 případech byly kmeny rezistentní téměř ke všem terapeuticky použitelným preparátům. Mnohé z dříve používaných preparátů tak dnes nelze použít v monoterapii, ale pouze v kombinacích [11] (nejúčinnější byla betalaktamová antibiotika s aminoglykosidy či fluorochinolony).

U kmenů získaných od hospitalizovaných pacientů byla tvorba biofilmu výrazně vyšší (50 %) než u kmenů od ambulantních pacientů (25 %) a mohla souviset s nutností katétrizace či jiných urologických zákroků, s horším klinickým stavem pacientů či polymorbiditou. Výrazná tvorba biofilmu u polyrezistentních kmenů je v souladu s četnými publikacemi o biofilmu [3, 4, 6, 12]. Preventabilita tvorby biofilmu pomocí potažení katétrů antimikrobiálními substancemi je sporná, přestože je efekt prokazován u centrálních venózních katétrů [5, 10]. Potenciální možností je použití kolicinů jako prevence kolonizace močových katétrů [15]. Již vzniklý biofilm lze ovlivnit řadou synergicky působících kombinací antibiotik [8, 9]. Slibná se zdá být léčba např. pomocí fosfomycinu v kombinaci s ofloxacinem. Efekt této kombinace zejména na močové infekce způsobené P. aeruginosa byl prokázán nejen in vitro, ale též in vivo u pacientů s chronickou pyelonefritidou [8]. V experimentální terapii se nově zkoušejí bakteriofágy nebo enzymy degradující matrix biofilmu [7].

Závěr

Rezistence pseudomonád zejména k fluorochinolonům je alarmující, stejně tak jako relativní počet polyrezistentních kmenů. Vzhledem k častému používání chinolonů i dalších antibiotik bude procento rezistence zřejmě ještě stoupat. Biofilm hraje svoji roli jako faktor patogenity, která je výraznější zejména u pacientů lůžkových oddělení a u polyrezistentních kmenů. S ohledem na získané výsledky lze potvrdit status P. aeruginosa jako obávaného a obtížně eradikovatelného původce infekcí močových cest.

Do redakce došlo 11.3.2009

MUDr. L. Černohorská

Mikrobiologický ústav LF MU a FN u sv. Anny v Brně

Pekařská 53

656 91 Brno

e-mail: lenka.cernohorska@fnusa.cz