Aminoglykozidy a kolistín potláčajú tvorbu biofilmu u Klebsiella pneumoniae

Overview

Cieľ práce:
Vyhodnotenie účinku subinhibičných koncentrácií (sub-MICs) amikacínu, tobramycínu a kolistínu na tvorbu biofilmu, na povrchovú hydrofobicitu, lipázu a odpoveď na oxidačný stres u dvoch klinických kmeňov K. pneumoniae.

Metodika:
Tvorbu biofilmu sme kvantitatívne vyhodnotili testom absorpcie kryštálovej violete, povrchovú hydrofobicitu adherenciou na xylén, lipázu spektrofotometrickou metódou s Tweenom 20 ako substrátom, oxidačný stres ako zónu vyčírenia obklopujúcu disk nasiaknutý peroxidom vodíka.

Výsledky:
Antibiotiká výrazne znížili tvorbu bakteriálneho biofilmu v priamej závislosti na koncentrácii. Najúčinnejšie boli v koncentráciách 1/2 a 1/4 MICs. Biofilm po účinku 1/2 sub-MICs amikacínu bol inhibovaný na 21,2 % (kmeň 39) a 22,6 % (kmeň 61/P), po tobramycíne na 25,1 % (39) a 19,5 % (61/P), po kolistíne na 7,4 % (39) a 19,1 % (61/P) kontrolných hodnôt (bez antibiotika). Podobne 1/4 MICs amikacínu zredukovala produkciu biofilmu na 28,6 % (39) a 28,9 % (61/P), tobramycínu na 35,3 % (39) a 20,5 % (61/P) a kolistínu na 8,7 % (39) a 20,4 % (61/P) kontrolných hladín. Biofilm bol najmenej redukovaný po kultivácii kmeňov s 1/16 MICs antibiotík. V týchto prípadoch jeho hodnota bola znížená na 80,4 % (39) a 97,7 % (61/P) kontrolných hodnôt po amikacíne, na 69,4 % (39) a 64,4 % (61/P) po tobramycíne, na 61,3 % (39) a 74,7 % (61/P) po kolistíne. Testované kmene boli silne hydrofilné a zmeny v povrchovej hydrofobicite účinkom antibiotík boli veľmi nepatrné. Kmene po pôsobení antibiotík vo väčšine prípadov vykazovali mierne zvýšenú citlivosť na oxidačný stres a zníženú aktivitu lipázy (s výnimkou kolistínu u kmeňa 39).

Záver:
Amikacín, tobramycín a kolistín v sub-MICs u kmeňov K. pneumoniae výrazne znížili tvorbu biofilmu, vo väčšine prípadov mierne zvýšili citlivost na oxidačný stres, znížili aktivitu lipázy ale adherenciu na xylén prakticky neovplyvnili.

Kľúčové slová:
Klebsiella pneumoniae - antibiotiká - biofilm.

Kmene Klebsiella spp. sú oportúnne patogény, ktoré atakujú hlavne imunokompromitovaných pacientov a novorodencov [14, 27]. Z lekárskeho hľadiska je najdôležitejší druh K. pneumoniae. Tieto baktérie môžu byť príčinou vážnych ochorení ako sepsa, pneumónia, infekcie močového traktu, infekcie mäkkých tkanív [21]. Tiež sú často príčinou nozokomiálnych infekcií. K. pneumoniae môže nadobudnúť rezistenciu na rôzne antibiotiká, a tak multirezistentné kmene predstavujú vážny terapeutický problém [15].

K. pneumoniae podobne ako celý rad ďalších baktérií môže rásť vo forme biofilmu. Biofilm je integrálny fenomén charakteristický pre prokaryonty od ich vzniku [9]. Je to plošná štruktúra vytvorená mikroorganizmami na pevnom podklade a v prostredí polymérneho materiálu, ktorý sami produkujú [6]. Rezistencia na antibiotiká bakteriálnych buniek rastúcich v  tejto forme je vyššia v porovnaní s planktónovou formou [1].

Viaceré literárne údaje dokumentujú ovplyvnenie gramnegatívnych ako aj grampozitívnych baktérií v experimentálnych podmienkach in vitro a in vivo po pôsobení antibiotík v subinhibičných koncentráciách (sub-MICs) [8, 12, 18]. Ukázalo sa, že antibiotiká aj v týchto nízkych koncentráciách môžu byť účinné. Sub-MICs antimikróbnych látok sú prítomné v organizme hlavne striedavo počas terapie, v intervale medzi dvomi dávkami a môžu byť potenciálne účinné v oslabení špecifickej bakteriálnej infekcie.

Cieľom tejto práce bolo vyhodnotiť vplyv sub-MICs amikacínu, tobramycínu a kolistínu na tvorbu biofilmu, povrchovú hydrofobicitu, aktivitu lipázy a odpoveď na oxidačný stres dvoch klinických kmeňov K. pneumoniae.

Materiál a metodika

Bakteriálne kmene K. pneumoniae boli izolované od pacientov z katétra (39) a z kanyly (61/P) a identifikované pomocou komerčne identifikačného kitu, Enterotest 24 (Lachema Brno, Česko) (RUVZ Trenčín a Komárno).

Antibiotiká kolistín (Fluka, Dánsko), tobramycín (Brulamycín, Debrecín, Maďarsko), amikacín (amikin, Bristol Myers Squibb, Česko) boli použité v tejto práci

Minimálnu inhibičnú koncentráciu (MIC) sme zisťovali makrodilučnou metódou. Ako médium sme použili Muellerov–Hintonov bujón obohatený o 25 mg Ca ²⁺/l a 12,5 mg Mg ²⁺/l (MHB). Najnižšiu koncentráciu antibiotika, ktorá inhibovala bakteriálny rast meraný spektrofotometricky po 24 hod inkubácii pri 37 °C, sme považovali za MIC.

Podmienky kultivácie.Bakteriálnu suspenziu 0,2 ml, A₆₀₀ = 0,5 ml, 9,7 ml MHB a 0,1 ml príslušného antibiotika v sub-MICs (1/2, 1/4, 1/8 a 1/16 MIC) ako aj kontrolnú kultúru (bez antibiotika) sme inkubovali 24 hod pri 37 °C na reciprokej trepačke. Po inkubácii sme bakteriálne suspenzie použili na vyhodnotenie oxidačného stresu, bunky po centrifugácii bakteriálnej suspenzie sme použili na vyhodnotenie hydrofobicity a produkcie biofilmu. V sterilných filtrátoch kultúr sme určovali lipázu.

Povrchovú hydrofobicitu baktérií sme vyhodnotili ich adherenciou na xylén meranú spektrofotometricky pri 400 nm [23].

Produkciu biofilmu sme kvantitatívne vyhodnotili testom absorbcie kryštálovej violete [25]. Relatívny obsah biofilmu sme určili z koncentrácie tejto farbičky eluovanej z odfarbených buniek v mikrotitračných platničkách kombináciou metód podľa O’Tooleho a Koltera [19] a Bonafonteho et al.[2] s miernymi modifikáciami tak, ako to bolo popísané v našej predchádzajucej práci [13].

Odpoveď baktérií na oxidačný stres vyvolaný reaktívnym oxidačným intermediátom (peroxid vodíka) sme vyhodnotili ako zónu vyčírenia obklopujúcu disky po 24 hod inkubácii pri 37 °C [10].

Lipolytickú aktivitusme vyhodnotili spektrofotometricky za použitia Tweenu 20 ako substrátu [16, 26].

Výsledky a diskusia

Biofilm je mikrobiálny fenomén, ktorý komplikuje starostlivosť o zdravie pacienta, predovšetkým znižovaním účinnosti chemoterapie a zvyšovaním rizika infekcie aj v prostredí ošetrenom antimikrobiálnymi látkami a štandardnými hygienicko-epidemiologickými opatreniami. Z hľadiska patogenetického potenciálu buniek tvoriacich biofilm in vivo je dôležitá ich rezistencia na antibiotiká, biocídy a na obranné mechanizmy makroorganizmu. Ukazuje sa, že na potlačenie vývoja rezistencie na monoterapiu môže byť účinná kombinácia antibiotík predstavujúca synergizmus, resp. čiastočný synergizmus proti baktériám [5, 17]. Počet infekcií zapríčinených tvorbou bakteriálnych biofilmov sa zvyšuje, a preto sa hľadajú stratégie ako tvorbu biofilmu inhibovať. Viaceré práce demonštrujú, že nízke koncentrácie antibiotík do určitého rozsahu môžu inhibovať tvorbu biofilmu [4, 20, 28], resp. môžu spôsobiť jej oneskorenie [7]. Redukcia biofilmu je doprevádzaná aj fyziologickými zmenami v baktériách (štruktúra matrice, povrchové vlastnosti, hrúbka biofilmu, rezistencia na antibiotiká) [3, 7]. Výsledky našej práce ukázali, že amikacín, tobramycín a kolistín v subinhibičných koncentráciách výrazne znížili tvorbu bakteriálneho biofilmu v priamej závislosti na koncentrácii (tab. 1, 2). Najúčinnejšie boli v koncentráciách 1/2 a 1/4 MICs. Biofilm po účinku 1/2 sub-MICs amikacínu bol potlačený na 21,2 % (kmeň 39) a 22,6 % (kmeň 61/P), po tobramycíne na 25,1 % (39) a 19,5 % (61/P), po kolistíne na 7,4 % (39) a 19,1 % (61/P) kontrolných hodnôt (bez antibiotiká). Podobne 1/4 MICs amikacínu zredukovala produkciu biofilmu na 28,6 % (39) a 28,9 % (61/P), tobramycínu na 35,3 % (39) a 20,5 % (61/P) a kolistínu na 8,7 % (39) a 20,4 % (61/P) kontrolných hladín. Biofilm bol najmenej potlačený po kultivácii kmeňov s 1/16 MICs antibiotík. V týchto prípadoch jeho hodnota bola znížená na 80,4 % (39) a 97,7 % (61/P) kontrolných hodnôt po amikacíne, na 69,4 % (39) a 64,4 % (61/P) po tobramycíne, na 61,3 % (39) a 74,7 % (61/P) po kolistíne. Kedže testované kmene boli silne hydrofilné (adherencia na xylén u kmeňa 39 v rozmedzí od 0- 3,9 %, u kmeňa 61/P od 0-5,8%) zmeny v povrchovej hydrofobicite účinkom antibiotík boli veľmi nepatrné. Kmene po pôsobení antibiotík vo väčšine prípadov vykazovali vyššiu citlivosť na oxidačný stres (s výnimkou kolistínu u kmeňa 39). Aktivita lipázy bola vo väčšine prípadov znížená (s výnimkou účinku kolistínu u kmeňa 39).

Na druhej strane, niektoré literárne údaje naznačili, že sub-MICs niektorých antibiotík môžu tvorbu biofilmu stimulovať, resp. ju neovplyvniť [22, 24]. Predpokladá sa, že tvorba biofilmu môže byť špecifická, obranná reakcia na prítomnost antibiotík a že molekulárne základy tejto odpovede zahrňujú zmeny na úrovni c-di-GMP [11].

Naše a uvedené literárne údaje demonštrujú variabilitu v ovplyvňovaní tvorby bakteriálneho biofilmu po účinku sub-MICs antibiotík. Treba brať do úvahy aj literárne zistenia, že inhibícia biofilmu po pôsobení nízkych koncentrácií antibiotík je doprevádzaná aj ďalšími zmenami ako napr. zvýšením bakteriálnej rezistencie na antimikrobiálne látky. Toto zistenie by malo byť podnetom pre hľadanie nových možností ovplyvnenia biofilmu.

Záver

Amikacín, tobramycín a kolistín v sub-MICs u  kmeňov K. pneumoniae výrazne znížili tvorbu biofilmu, vo väčšine prípadov mierne zvýšili citlivosť na oxidačný stres, znížili aktivitu lipázy a adherenciu na xylén prakticky neovplyvnili.

Vyslovujeme svoje poďakovanie pani A. Korenačkovej a K. Slimákovej za technickú spoluprácu.

Táto práca bola podporovaná Ministerstvom zdravotníctva SR v rámci projektu Analýza tvorby biofilmu u nozokomiálnych bakteriálnych kmeňov ako základ pre prevenciu infekcií v zdravotníckych zariadeniach č. 2005/24-SZU-02.

Do redakce došlo 15. 4. 2008

Ing. A. Hoštacká,CSc.

Slovenská zdravotnícka univerzita

Limbova 12

833 03 Bratislava

Slovenská republika

e -mail:anna.hostacka@szu.sk