Vyšetření produkce intracelulárních cytokinůT lymfocyty pomocí průtokové cytometrie – metodicképroblémy

Metoda stanovení intracelulárních proteinů pomocí průtokové cytometrie umožňuje hodnoceníprodukce různých cytokinů jasně definovanou buňkou (typ subpopulace, stav aktivace buňky).K tomu, aby se metoda mohla stát rutinně používaným funkčním testem, je potřeba ji standardizovat.To bylo cílem naší práce, kdy jsme podle literárních údajů našli všechny sporné bodya ty jsme experimentálně řešili. Zcela jednoznačně lze doporučit pouze natrium heparin jakoantikoagulační činidlo při vyšetřování plné krve. Práce řeší problémy s výběrem mitogenů, kdyukazujeme výrazný vliv použití mitogenů na výsledek a nutnost porovnávat výsledky získané pouzeza zcela stejných podmínek. Dále jsme testovali možnosti uchování krve před zpracováním a výběrvhodných kombinací povrchových znaků a cytokinů. Při hledání optimální doby kultivace je třebaprovést kompromis mezi co nejvyšší možnou produkcí cytokinů (kinetika produkce různých cytokinůje navíc odlišná) a přesností měření, protože detekce molekuly CD4 je po delší době stimulacevýrazně horší. Jako optimální navrhujeme 4,5hodinovou kultivaci s phorbol myristat acetátem.Naše výsledky jasně prokazují mnohem vyšší schopnost zadržet nově tvořené cytokiny v buňce,používáme-li brefeldinAnamísto monensinu. Výsledkempráce je standardní protokolpro stanoveníintracelulárních cytokinů.

Klíčová slova:
intracelulární cytokiny – mitogeny – inhibitory transportu proteinů.