Tyreoglobulin a další parametry laboratorní diagnostiky při léčbě hypotyreózy u dětí

Cíl práce:
V práci je diskutován tyreoglobulin jako vhodný ukazatel fyziologických či patofyziologických dějů odehrávajících se ve štítné žláze u šesti nově diagnostikovaných dětských pacientů s hypofunkcí štítné žlázy, kteří byli sledováni po dobu 2–3 let v přibližně 3–5měsíčních intervalech jak z hlediska klinického vyšetření, tak i z hlediska kompletní laboratorní diagnostiky funkce štítné žlázy. Byly u nich stanoveny následující parametry: tyreotropin (TSH), volné frakce tyroxinu (FT4) a trijodtyroninu (FT3), celkový tyroxin (T4) a trijodtyronin (T3), reverzní trijodtyronin (rT3), tyreoglobulin (Tg), transportní globulin pro hormony štítné žlázy (TBG), autoprotilátky proti Tg (antiTg), autoprotilátky proti tyreoidální peroxidáze (antiTPO), autoprotilátky proti TSH receptoru (antiTSHr) a jod v moči.

Pacienti:
Dva ze 6 dětských pacientů (4 dívky a 2 chlapci ve věku 9–14 let) pacientů měli diagnostikovanou chronickou autoimunitní tyreoiditidu vedoucí k hypotyreóze, kde kromě vysokých autoprotilátek vůči Tg a TPO byly v počáteční fázi detekovány také autoprotilátky vůči TSH receptoru. Další 2 pacienti měli chronickou formu autoimunitní tyreoiditidy s počáteční hypotyreózou a s vysokými koncentracemi antiTg a antiTPO, ale nebyly zde zjištěny autoprotilátky vůči TSH receptoru. U posledních dvou dětí byla diagnostikována chronická forma neautoimunitní tyreoiditidy s počáteční hypotyreózou a u těchto pacientů se hodnoty antiTg, antiTPO a antiTSHr pohybovaly uvnitř referenčního rozmezí. Po určení diagnózy byl pacientům podáván L-tyroxin v denní dávce 0,73 až 2,13 µg L-T4/kg a den.

Metody:
Tyreoidální hormony a faktory byly stanoveny v séru pomocí komerčně dostupných kitů firem Roche Diagnostics, Zentech S.A. a Brahms. Jod v moči byl měřen naším laboratorním postupem využívajícím alkalického tavení vzorků moči s provedením následné Sandellovy-Kolthoffovy reakce v mineralizátu.

Výsledky:
Je možné konstatovat, že hladina Tg klesá během úspěšné léčby hypotyreózy. Pokles Tg je tedy indikátorem zlepšujícího se stavu štítné žlázy.

Závěr:
Dynamika změn cirkulujícího Tg může přispět ke zlepšení laboratorní diagnostiky štítné žlázy a význam stanovení Tg je mnohem rozsáhlejší než jeho běžné použití jako ukazatele stavu pacientů s diferencovaným karcinomem štítné žlázy.

Klíčová slova:
tyreoglobulin, hypotyreóza, laboratorní diagnostika štítné žlázy

ÚVOD

Při zjištění hypofunkce štítné žlázy je nezbytné nasadit léčbu, která je dlouhodobá a je kontrolována jak klinickým vyšetřením, tak i pomocí laboratorní diagnostiky. Stanovení hormonů a faktorů štítné žlázy v cirkulaci by mělo nejen optimalizovat způsob léčby, ale také poukázat na případné problémy, které ve stavu pacienta mohou nastat. Otázkou je, které ze všech hormonů a faktorů štítné žlázy jsou k tomuto účelu vhodné a jaké změny u těchto parametrů nastávají. Odpověď jsme se snažili najít při výzkumu souboru 6 dětí trpících hypotyreózou, které byly dlouhodobě v přibližně 3–5měsíčních intervalech sledovány po dobu téměř 3 let. U těchto pacientů byly stanoveny tyreotropin (TSH), volné frakce tyroxinu (FT4) a trijodtyroninu (FT3), celkový tyroxin (T4) a trijodtyronin (T3), reverzní trijodtyronin (rT3), tyreoglobulin (Tg), transportní globulin pro hormony štítné žlázy (TBG), autoprotilátky vůči Tg (antiTg), vůči tyreoidální peroxidáze (antiTPO) a vůči TSH receptoru (antiTSHr). Zásobení štítné žlázy jodem bylo kontrolováno stanovením jodu v moči.

Při hypotyreóze je vzhledem k nedostatku tyreoidálních hormonů zvýšena produkce TSH, která by ale měla být rychle potlačena po nasazení substituční léčby. Koncentrace TSH a volných či celkových hormonů štítné žlázy udává, zda je substituční léčba účinná. Změny hormonů štítné žlázy v cirkulaci ale nedávají jasný obrázek o tom, zda patofyziologické změny ve štítné žláze pokračují, zda se je povedlo zastavit a naopak, zda byly nastartovány děje vedoucí k plné obnově funkce štítné žlázy. rT3 může být důležitý z hlediska organifikace jodu a bilance biosyntézy tyreoidálních hormonů, vyjadřuje také míru aktivity dejodáz typu I a III jak ve štítné žláze, tak na periferii, ale jeho úloha při porušené funkci štítné žlázy zatím není zcela jasná. V případě hypotyreózy by měly být nalezeny snížené hodnoty rT3, naproti tomu hodnoty rT3 se zvyšují při vážném fyzickém stresu a při hladovění z důvodu aktivace dejodáz, které tak snižují výdej energie [1]. Změna koncentrace TBG je důležitá tím, že na něm záleží, jaká je výsledná hladina celkových frakcí tyreoidálních hormonů v cirkulaci. Vzhledem k tomu, že TBG je produkován v játrech a jeho biosyntéza je ovlivněna i jinými mechanismy než pouze biologickou funkcí tyreoidálních hormonů, tak ani v tomto případě nelze předpokládat, že by koncentrace TBG mohla odrážet patofyziologické děje probíhající ve štítné žláze.

Koncentrace autoprotilátek má přímou souvislost s patofyziologií štítné žlázy a alespoň jedna z autoprotilátek, tj. antiTg nebo antiTPO, je přítomna v téměř 100 % případů autoimunitní hypotyreózy [2], přičemž antiTSHr zpřesňuje mechanismus postižení štítné žlázy. V případě neautoimunitní hypotyreózy jsou tyto protilátky v referenčním rozmezí. Na druhé straně přibližně u 10 % zdravé populace autoprotilátky vůči Tg nebo TPO přesahují referenční rozmezí, ale přitom není prokázáno poškození štítné žlázy [3]. Nedostatečný, ale i nadměrný přívod jodu do organismu sám o sobě způsobuje poruchy ve funkci štítné žlázy [4, 5, 6] a zřejmě také potencuje patofyziologické změny, které se odehrávají při porušené tyreoidální funkci. Stanovení  jodurie je tak důležité z hlediska zajištění podmínek pro správnou funkci štítné žlázy, ale opět nemůže přímo sloužit k indikaci změn probíhajících ve štítné žláze z důvodů jejího onemocnění. Z tohoto hlediska je nejdůležitější pro zaznamenání zlepšující se či zhoršující se funkce štítné žlázy její sonografické vyšetření.

Spolu s klinickým vyšetřením štítné žlázy je možné uvažovat i o Tg jako o vhodném ukazateli fyziologických či patofyziologických dějů odehrávajících se ve štítné žláze. Důvodem je, že koncentrace Tg v cirkulaci závisí v zásadě na třech faktorech [7]. Prvním faktorem je hmota diferencované tkáně štítné žlázy, druhým faktorem je jakékoliv fyzické poškození štítné žlázy či její zánět, a třetím faktorem je míra stimulace štítné žlázy tyreotropinem. Tg je vytvářen pouze ve štítné žláze, kde se podílí na organifikaci jodu a tím i na biosyntéze tyreoidálních hormonů. Jedná se o hlavní jodoglykoprotein štítné žlázy s molekulovou hmotností 660 kDa. Tg obsahuje přibližně 0,1–2 % jodu, 8–10 % karbohydrátů tvořených galaktosou, manosou, fukosou, N-acetylglukosaminy a sialovou kyselinou [8]. Skládá se ze dvou identických podjednotek (homodimér) a patří do rodiny proteinů typu B-karboxylesteráza/lipáza [9]. Tyreoidální hyperplazie a struma charakteristické pro oblasti se závažným jodovým deficitem zvyšují koncentraci Tg v cirkulaci a Tg tak může sloužit i jako dlouhodobý ukazatel jodové nutrice [10, 11]. Podle Zimmermanna et al. [12] mediánové hodnoty Tg mezi 13 až 40 µg/L indikují přiměřený jodový příjem u dětí ve stáří 5 až 14 let. Podle našich údajů by měla být hodnota Tg >40 µg/L důvodem ke stanovení jodu v moči [13].

Imunoanalytické stanovení Tg je problematické z hlediska poměrně velké variability výsledků při použití kitů různých výrobců. Při stanovení normálních hodnot Tg se také nebere v úvahu míra jodového příjmu [11]. Hlavní příčinou rozdílných výsledků mezi kity různých výrobců je intra- i interindividuální nehomogenita velké molekuly Tg, kdy v cirkulaci jsou nacházeny různé izoformy Tg lišící se jak v primární struktuře, tak i v obsahu jodu a karbohydrátů. Tím je přímo ovlivněna prostorová struktura molekuly Tg, kdy mohou být některé epitopy důležité pro imunoanalytické interakce skryty a naopak se mohou objevit neoantigenní domény. Navíc je imunoanalýza Tg limitována také přítomností autoprotilátek vůči Tg, které obecně zhoršují míru správnosti, tj. přesnosti a pravdivosti imunoanalyticky stanoveného Tg. Postiženy jsou především imunometrické (sendvičové) analýzy, které jsou charakteristické falešně nízkými výsledky [14]. Kompetitivní imunoanalýza je vůči Tg autoprotilátkám odolnější [15], ale i zde se může projevit snížení dostupnosti značeného Tg sloužícího jako ukazatel míry kompetice v rámci imunoanalytického procesu, což vede k falešně vysokým výsledkům. Nadbytečný příjem jodu [5] nebo zavedení programu jodové profylaxe [6] má většinou za následek zvýšení prevalence autoprotilátek vůči Tg. Imunoanalytické stanovení Tg může být také ovlivněno přítomností heterofilních protilátek, což vede u imunometrické analýzy k falešně vysokým výsledkům Tg [16, 17], naopak pro kompetitivní imunoanalýzu jsou charakteristické spíše falešně nízké výsledky. V současné době je tento problém řešen používáním činidel blokujících heterofilní protilátky [18]. Výsledkem mezinárodní spolupráce pod patronací úřadu pro reference (Community Bureau of Reference) Komise evropského společenství je výroba a distribuce Tg standardu CRM-457 [19, 20], jehož používání snížilo variační koeficient intereseje při porovnání Tg kitů od různých výrobců ze 47 % na 37 % [15]. Tato hodnota ale není uspokojivá a ukazuje na přetrvávání podstatných rozdílů při stanovení Tg. Možná důležitější než použití referenčního materiálu CRM-457 by bylo vzhledem ke komplikované prostorové struktuře Tg standardizovat analytické protilátky specifické vůči Tg [21]. Určitým příslibem do budoucna je možnost stanovit Tg pomocí hmotové spektrometrie [22, 23], kde autoprotilátky či heterofilní protilátky nemají na správnost stanovení vliv.

SOUBOR PACIENTŮ

Do studie bylo zařazeno 6 dětí (4 dívky a 2 chlapci ve věku 9–14 let) s diagnostikovanou hypofunkcí štítné žlázy, která nebyla do doby lékařského vyšetření v Endokrinologickém ústavu léčena. Po určení diagnózy byl pacientům podáván L-tyroxin v denní dávce 0,73 až 2,13 µg L-T4/kg a den. V závislosti na růstu a vývoji dětských pacientů a na průběžném klinickém vyšetření endokrinologem včetně sonografického vyhodnocení stavu štítné žlázy a vyhodnocení tyreoidálních laboratorních parametrů byly podávané dávky L-tyroxinu podle potřeby upravovány.

Pacienti byli rozděleni po dvojicích do 3 skupin na základě povahy jejich onemocnění. Do skupiny 1 byly zařazeny 2 dívky s chronickou autoimunitní tyreoiditidou vedoucí k hypotyreóze, kde kromě vysokých autoprotilátek vůči Tg a TPO byly v počáteční fázi detekovány také autoprotilátky vůči TSH receptoru. Skupina 2 (dívka a chlapec) měla chronickou formu autoimunitní tyreoiditidy s počáteční hypotyreózou a s vysokými koncentracemi antiTg a antiTPO, ale nebyly zde zjištěny autoprotilátky vůči TSH receptoru. U skupiny 3 (dívka a chlapec) byla diagnostikována chronická forma neautoimunitní tyreoiditidy s počáteční hypotyreózou, u těchto pacientů se hodnoty antiTg, antiTPO a antiTSHr pohybovaly uvnitř referenčního rozmezí.

Při zahájení léčby a v jejím průběhu byli pacienti v přibližně 3–5měsíčních intervalech po dobu 2–3 let sledováni jak z hlediska klinického vyšetření, tak i kompletní laboratorní diagnostiky funkce štítné žlázy, tj. byly u nich stanoveny TSH, FT4, FT3, T4, T3, Tg, antiTg, antiTPO, antiTSHr, TBG, rT3 a jodurie.

METODY

Laboratorní vyšetření

Tyreoidální hormony a faktory byly stanoveny v séru pomocí imunoanalytických postupů, jejichž stručná charakterizace je uvedena v tabulce 1. Při imunometrickém stanovení Tg pomocí jednokrokové elektrochemiluminometrické eseje (ECLIA, kód 05118921 190 Elecsys Tg Immunoassay, Roche Diagnostics, Mannheim, Německo) byly standardy kalibrovány vůči referenčnímu etalonu CRM-457. Imunometrickým elektrochemiluminiscenčním postupem s využitím monoklonálních protilátek a streptavidinové technologie firmy Roche byl stanoven také TSH. Kompetitivním způsobem s využitím elektrochemiluminometrické analýzy a streptavidinové technologie byly stanoveny kity firmy Roche FT4, T4, FT3, T3, antiTg, antiTPO a antiTSHr. rT3 byl stanoven kompetitivním RIA (radioimunoanalýza) kitem firmy Zentech S.A., Angleur, Belgie, a TBG byl stanoven kompetitivním RIA kitem firmy Brahms, Henningsdorf, Německo.

Referenční rozmezí pro jednotlivé analýzy vztažené na požadovaný věk pacientů byly určeny na základě firemních  materiálů firmy Roche (Reference Intervals for Children and Adults, Elecsys Thyroid Tests, Roche, 2009) a firmy Brahms (příbalové informace v balení kitů). Nejsou známy korekce referenčního rozmezí vzhledem k věku pro analýzu rT3 (firma Zentech) a antiTSHr (firma Roche). Jodurie byla měřena naším laboratorním postupem využívajícím alkalického tavení vzorků moči s provedením následné Sandellovy-Kolthoffovy reakce v mineralizátu s využitím brucinu jako kolorimetrického indikátoru [24]. Referenční rozmezí 100–200 µg/L odpovídá adekvátnímu jodovému přísunu podle WHO, UNICEF a ICCIDD [10].

Statistika a výpočty

Veškeré statistické výpočty byly prováděny pomocí počítačového programu NCSS 2004 (Number Cruncher Statistical Systems, Kayville, Utah, USA). Jednotlivé body v časové řadě vyšetření byly proloženy Newtonovým polynomem programovaným až do 12. stupně pomocí našeho vlastního programu pracujícího v prostředí Lotus 1-2-3 firmy IBM Corporation, USA. Použitý stupeň polynomu byl dán počtem vyšetření v jednotlivé časové řadě.

VÝSLEDKY

Celkem bylo provedeno 36 kompletních sad vyšetření, výsledky jsou znázorněny na obrázku 1. Z obrázku je patrné, že léčba L-tyroxinem byla úspěšná a u všech pacientů se již v počáteční fázi léčby snížila koncentrace TSH (obr. 1A) a došlo ke zvýšení hodnot FT4 (obr. 1B) i T4 (obr. 1C). Paralelně se zvýšením tyroxinu se zvyšoval i FT3 (obr. 1D), T3 (obr. 1E) a rT3 (obr. 1F), ale tyto změny se pohybovaly uvnitř referenčního rozmezí. Na hodnoty TBG (obr. 1K) a jodurie (obr. 1L) podání L-tyroxinu nemělo podstatný vliv. Hodnoty TBG byly ve všech případech uvnitř referenčního rozmezí a jodurie se až na pár výjimek pohybovala od adekvátního až po mírně nadměrný příjem jodu. Na hladinu autoprotilátek vůči Tg (obr. 1H) nebo TPO (obr. 1I) léčba u skupiny 1 a 2 neměla velký vliv, autoprotilátky po celou dobu sledování přesahovaly referenční rozmezí a v některých případech dokonce dále stoupaly. U skupiny 3 s neautoimunitní tyreoiditidou byly autoprotilátky v rámci referenčního rozmezí. Byl ale zaznamenán pokles antiTSHr (obr. 1J) u skupiny 1. Z obrázku 1 je patrné, že daná léčba byla úspěšná a pacienti se dostali do dlouhodobého eufunkčního stavu.

Velmi zajímavé jsou změny koncentrace Tg (obr 1G), kdy s pokračující léčbou se koncentrace Tg snižovaly. Tg v tomto smyslu může sloužit jako ukazatel úspěšnosti léčby a pokles jeho koncentrace by mohl korelovat s dobrou prognózou pacientů. Detailněji jsou změny Tg zaznamenány v grafu 1. U všech pacientů byly hodnoty Tg v dané časové řadě proloženy Newtonovým polynomem pátého až šestého stupně, z rovnice křivek byla vypočtena průměrná koncentrace Tg v čase 0, 30, 60, 90 a 120 týdnů, a tyto hodnoty byly opět proloženy Newtonovým polynomem. Výsledky jsou znázorněné v grafu 1, kde je ukázána zprůměrovaná křivka Tg z hodnot všech pacientů v daných časových řadách. Z grafu 1 je patrné, že úspěšnost léčby je možné posuzovat z poklesu hodnot Tg v daném časovém období, vzestup Tg by tak mohl znamenat prohloubení patofyziologických procesů odehrávajících se ve štítné žláze.

DISKUSE

Substituční léčba vede u pacientů s hypofunkcí štítné žlázy k exogenní náhradě chybějících tyreoidálních hormonů a jejím cílem je dostat pacienty do eufunkčního stavu. Mírou tohoto děje je pokles hodnot TSH a naopak vzestup hodnot FT4 a T4 doprovázený i případným vzestupem FT3, T3 a rT3. Zásadní jsou hodnoty tyroxinu, který je přímo syntetizován ve štítné žláze a při onemocnění štítné žlázy je jeho produkce buď nedostatečná, nebo nadměrná. V malém množství je trijodtyronin také syntetizován ve štítné žláze, ale podstatný je jeho vznik na periferii, kde dochází ke konverzi tyroxinu na trijodtyronin nebo rT3 za působení dejodáz typu I, II a III. Vzhledem k tomu, že T3 je biologicky nejúčinnějším hormonem štítné žlázy, organismus se snaží udržet hodnoty T3 (FT3) do poslední možné chvíle ve fyziologickém rozmezí a poruchy štítné žlázy se projevují především ve snížení sérových hodnot tyroxinu. Stanovení TSH a tyreoidálních hormonů je důležité proto, že tak může být monitorována dávka exogenního tyroxinu potřebná k tomu, aby se pacient dostal do eufunkčního stavu.

Tato měření ale mají jen omezenou souvislost s patofyziologickými pochody, které se v rámci daného onemocnění odehrávají ve štítné žláze. Lepším ukazatelem stavu štítné žlázy se zdá být dynamika změn cirkulujícího Tg, jehož jediným místem biosyntézy je štítná žláza a který je uvolňován do cirkulace v závislosti na míře poškození štítné žlázy [7, 10]. Z našich výsledků vyplývá, že v průběhu úspěšné léčby hypotyreózy klesá hladina Tg (obr. 1G, graf 1) a pokles hodnot Tg tak je indikátorem zlepšujícího se stavu štítné žlázy. Nedostatečný příjem jodu má negativní vliv na průběh onemocnění štítné žlázy a v této situaci je závažné zjištění, že ačkoliv v ČR není jodový deficit u celkové populace od roku 2000 závažným zdravotním problémem, jodové zásobení těhotných matek a novorozenců není bez zvláštních opatření dostatečné, z čehož vyplývají i možné následky při poruchách činnosti štítné žlázy [25].

Problémy související s imunoanalytickým stanovením Tg jsou dány především výskytem autoprotilátek vůči Tg a variabilitou konfigurace i konformace velké molekuly Tg v závislosti na izotypech daných jak mírou obsahu jodu a glykosidů, tak i změnami v primární struktuře Tg. Je tak problematické srovnávat výsledky stanovení Tg získané pomocí kitů od různých výrobců a také je velká variabilita v normálním referenčním rozmezí [4]. Málo známé jsou i změny Tg v souvislosti s těhotenstvím a laktací a závislost Tg na stáří nebo pohlaví [26]. Také vliv zásobení organismu jodem se bude promítat do výsledků stanovení Tg [12]. Tyto otázky by měly být součástí dalšího výzkumu.

Přesto je ale možné závěrem konstatovat, že dynamika změn cirkulujícího Tg může přispět ke zlepšení laboratorní diagnostiky štítné žlázy a že význam stanovení Tg je mnohem rozsáhlejší než jeho běžné použití jako ukazatele stavu pacientů s diferencovaným karcinomem štítné žlázy.

Poděkování

Práce byla podpořena granty IGA MZ ČR NS/9837-4 a MZ ČR – RVO (Endokrinologický ústav – EÚ, 00023761).

Doc. Ing. Radovan Bílek, CSc.

Endokrinologický ústav

Národni 8

116 94 Praha 1

e-mail: rbilek@endo.cz