Výsledky rozšířeného novorozeneckého screeningu v České republice

Pomocí celoplošného novorozeneckého laboratorního screeningu ze suché kapky krve (SKK) na filtračním papírku jsou od roku 1975 vyhledáváni pacienti s fenylketonurií/hyperfenylalaninemií (PKU/HPA); od roku 1985 s vrozenou hypotyreózou (CH); od roku 2006 s kongenitální adrenální hyperplazií (CAH) a od X/2009 pacienti s cystickou fibrózou (CF) a 9 dalšími dědičnými poruchami metabolismu – leucinózou (MSUD), glutarovou acidurií typu I (GA I), izovalerovou acidurií (IVA), deficitem dehydrogenázy acyl-CoA se středně dlouhým, 3-hydroxyacyl-CoA s dlouhým a acyl-CoA s velmi dlouhým řetězcem (MCADD, LCHADD a VLCADD), deficitem karnitinpalmitoyltransferázy I a II (CPTD I a II) a deficitem karnitinacylkarnitintranslokázy (CACTD).

Metodika:
V období od 1. ledna 2002 až do 31. prosince 2012 bylo vyšetřeno 1 179 136 novorozenců na PKU//HPA a CH; koncentrace fenylalaninu byla měřena různými metodami a od X/2009 jednotně tandemovou hmotnostní spektrometrií (MS/MS); koncentrace tyreotropinu byla zjišťována pomocí fluoroimunoeseje (FIA). U 752 922 novorozenců byla změřena koncentrace 17-hydroxyprogesteronu pomocí FIA. U 367 114 dětí byl změřen imunoreaktivní trypsin (IRT) pomocí FIA a u 1,05 % novorozenců s nejvyšším IRT bylo vyšetřeno v prvotních SKK 32 a později 50 nejčastějších mutací v genu CFTR s cílem minimalizovat falešnou pozitivitu. U 362 653 novorozenců byly analyzovány metabolity pro záchyt dalších 9 dědičných metabolických poruch pomocí MS/MS.

Výsledky:
Celkem bylo novorozeneckým screeningem zachyceno 646 pacientů s následně potvrzenou diagnózou. Screeningové prevalence jednotlivých nemocí byly následující CH 1:3562; CAH 1:12 343; CF 1:7060; PKU/HPA 1:7234; MCADD 1:17 269; LCHADD 1:51 808; VLCADD 1:90 663; GA I 1:120 884; MSUD a IVA shodně 1:181 327. Screeningem dosud nebyl zachycen žádný novorozenec s CPTD I, II a CACTD. Efektivita screeningového programu v ČR se zvyšovala, kumulativní četnost záchytů narůstala z 1:2701 v letech 2002–2005 přes 1:2072 v letech 2007–2008 až na 1:1138 po zásadním rozšíření novorozeneckého screeningu (NS) v roce 2009. Četnost falešné pozitivity (FPR) činila 0,540 % , z toho 74 % reprezentuje NS CAH.

Závěr:
NS je účinný nástroj sekundární prevence vzácných onemocnění s účinnou léčbou. Pro optimalizaci programu se zavádějí druhostupňová vyšetření u malého množství vzorků s cílem snížit falešnou pozitivitu a hledají se možnosti rozšíření spektra screenovaných chorob.

Klíčová slova:
novorozenecký screening, suchá kapka krve, prevalence, vzácná onemocnění, kongenitální hypotyreóza, kongenitální adrenální hyperplazie, cystická fibróza, fenylketonurie, dědičné metabolické poruchy

ÚVOD

Pod pojem novorozenecký screening (NS) lze v širším smyslu zahrnout jakékoliv preventivní vyšetření novorozence, v užším smyslu se tímto pojmem myslí systematické vyhledávání léčebně ovlivnitelných chorob v jejich preklinickém stadiu. Laboratorní novorozenecký screening je založen na odběru kapilární krve na filtrační papírek (tzv. suché kapky krve, SKK) podle přesně dohodnutých pravidel všem novorozencům na definovaném území (většinou celostátně). SKK se následně vyšetřují v centrálních laboratořích. Tento typ NS je předmětem předkládaného sdělení.

Zakladatelem NS je profesor Robert Guthrie z univerzity v Buffalu ve státě New York, USA. V roce 1963 vyvinul a následně i zavedl do praxe jednoduchou, levnou a spolehlivou semikvantitativní metodu měření koncentrace fenylalaninu (založenou na principu inhibice růstu bakterií) pro NS fenylketonurie [1]. Od té doby se spektrum vyhledávaných chorob stále rozšiřuje. Tabulka 1 uvádí poslední známá data z let 2010/2011 o NS prováděných v Evropě [2]. V jednotlivých státech USA je počet screenovaných chorob v současné době mnohem vyšší, ve většině států mezi 40–50 s maximem 54 nemocí v Minnesotě [3]. Odborné zastřešení NS poskytuje mezinárodní společnost ISNS, International Society for Neonatal Screening, http://www.isns-neoscreening.org/, která organizuje pravidelné celosvětové a regionální (kontinentální) kongresy. Např. 6. evropský kongres této organizace se konal v roce 2009 v Praze a bylo mu věnováno samostatné číslo Česko-slovenské pediatrie [4].

Od počátku 70. let minulého století se datují pilotní studie NS fenylketonurie (PKU) v naší republice [5, 6], který se v roce 1975 stal naším prvním, pravidelně prováděným celostátním screeningovým programem. Jako druhý v pořadí byl v roce 1985 zaveden NS kongenitální hypotyreózy (CH) [7]. Dalším rozšířením bylo přidání kongenitální adrenální hyperplazie (CAH) v roce 2006 [8]. K poslednímu významnému rozšíření NS v ČR došlo v říjnu 2009, kdy do spektra vyhledávaných onemocnění byla přidána cystická fibróza (CF) [9] a 9 dalších dědičných metabolických poruch [10, 11, 12]. Tabulka 2 shrnuje v současnosti vyhledávaná onemocnění v ČR a hlavní důvod, proč je potřebná jejich včasná detekce. Všechna onemocnění vyhledávaná pomocí NS splňují definici vzácných onemocnění („rare disease“, RD, prevalence <1:2000), proto se NS stává modelovým nástrojem diagnostiky a léčby RD a zásadním způsobem může pomoci naplňovat směrnice Evropské unie a usnesení Vlády ČR pro RD [13, 14].

Systém NS nespočívá pouze v laboratorní analýze, ale musí zajišťovat i bezchybnou logistiku preanalytické části (informovaný souhlas rodičů; způsob, podmínky, časování a event. opakování odběrů suché kapky krve), navazující analytické části (jaké analyty, jakým způsobem a kde jsou měřeny, nastavení hranice mezi negativitou a pozitivitou – „cut-off“) a konečně postanalytické části (postupy screeningových laboratoří při pozitivním či nejasném nálezu, návaznost na klinická pracoviště ověřující podezření na nemoc podle obecně přijatých definic a konečně i zabezpečení dlouhodobé léčby a sledování pacientů). Celý program se periodicky hodnotí, průběžně se zpracovávají data ze screeningu a nastavují či upravují se pravidla. Sběr dat a hodnocení programu zajišťuje Koordinační centrum pro novorozenecký screening ve Všeobecné fakultní nemocnici v Praze (KCNS) ustanovené Ministerstvem zdravotnictví ČR, které sdružuje všechny laboratoře provádějící NS a zástupce MZ ČR. Způsob provádění NS v ČR je podrobně definován „Metodickým návodem k zajištění celoplošného novorozeneckého laboratorního screeningu a následné péče“, který se v několikaletých intervalech aktualizuje podle dosaženého stupně medicínského poznání, rozvoje NS a celospolečenských podmínek. Metodický návod se publikuje ve Věstníku Ministerstva zdravotnictví ČR. Poslední aktualizace byla zveřejněna v srpnu 2009 [15]. Přesné znění Metodického návodu a řadu dalších informací, sdělení a odpovědí KCNS pro odbornou i laickou veřejnost lze nalézt na webových stránkách http://www.novorozeneckyscreening.cz.

Smyslem tohoto sdělení je vyhodnotit výsledky NS v ČR ve vztahu k jeho postupnému rozšiřování.

SOUBOR, METODIKA

Sledované období 11 let mezi 1. 1. 2002 až 31. 12. 2012 zahrnuje všechny fáze postupného rozšiřování NS, tak, aby bylo možno porovnat kumulativní četnost zachycených pacientů (tzv. „detection rate“) v jednotlivých fázích rozšiřování. Celkem bylo vyšetřeno 1 179 136 novorozenců na hyperfenylalaninemii (PKU//HPA) a CH; koncentrace fenylalaninu byla měřena původní „Guthrieho“ bakteriálně inhibiční metodou, později enzymoimunoesejí (Quantase^®, firmy Biorad) či chromatograficky; od X/2009 se vyšetřuje jednotně tandemovou hmotnostní spektrometrií (kity MassChrom^® Reagent firmy Chromsystems; MS/MS přístroje API 2000TM, API 3200TM a API 4000TM firmy AB Sciex); koncentrace tyreotropinu byla stanovena pomocí fluoroimunoeseje (FIA; Delfia^® a AutoDelfia^® firmy Perkin--Elmer). U 752 922 novorozenců byla změřena koncentrace 17-hydroxyprogesteronu v SKK pomocí FIA. U 367 114 dětí byl změřen imunoreaktivní trypsin (IRT) pomocí FIA a u 3859 (1,05 %) z nich s nejvyšším IRT byla provedena analýza CFTR genu (bylo vyšetřováno 32, později 50 nejčastějších mutací pomocí esejí Elucigene CF-EU1TM/Elucigene CF-EU2TM firmy Gen-Probe) v originálních SKK, ve kterých byla zjištěna vysoká koncentrace IRT. Analýza CFTR genu ve druhém stupni NS CF má jediný cíl a výstup – minimalizaci falešně pozitivních výsledků. U 362 653 novorozenců byly analyzovány metabolity pro záchyt dalších 9 dědičných metabolických poruch pomocí výše uvedené MS/MS techniky.

V případě zjištění hodnoty analytu pod „cut-off“ hodnotou byl výsledek NS považován za negativní a proband nebyl dále vyšetřován. Při pozitivní hodnotě analytu byl proband předán ke konfirmaci diagnózy, léčbě a dalšímu sledování příslušnému klinickému pracovišti. Při nejasném výsledku v tzv. „šedé zóně“, kdy hodnota analytu byla mezi „cut-off“ a jasnou pozitivitou, byl odběr SKK na filtračním papíře opakován. Počet opakovaných odběrů SKK s konečným negativním výsledkem v opakovaném odběru, tj. s poklesem hodnoty analytu pod „cut-off“ se vyjadřuje v procentech jako četnost falešné pozitivity („false positivity rate“ – FPR). Zdrojem dat o počtu detekovaných i nedetekovaných pacientů byla hlášení klinických pracovišť screeningovým laboratořím. Diagnóza byla opřena o diagnostický standard platný v dané době. Uvedení konkrétních hodnot analytů pro „cut-off“ a pozitivitu, konfirmaci diagnóz podle domluvených definic a i uvedení léčby a follow-up přesahuje rozsah a smysl tohoto sdělení, zájemce odkazujeme na sekci „Pro odbornou veřejnost“ webových stránek http://www.novorozeneckyscreening.cz.

VÝSLEDKY A DISKUSE

Výsledky NS v ČR v průběhu postupného rozšiřování spektra vyhledávaných onemocnění ve sledovaném období ukazuje tabulka 3.

Zlepšující se schopnost celého systému NS v ČR detekovat pacienty s vrozeným či dědičným vzácným onemocněním dokládá kumulativní četnost záchytů, která narůstala z 1:2701 v letech 2002–2005 přes 1:2072 v letech 2007–2008 po rozšíření o CAH až na 1:1138 po posledním rozšíření NS v roce 2009 o CF a dalších 9 DMP. Efektivita screeningového programu se tak mezi lety 2005 a 2012 zvýšila více než 2,5krát a dosahuje parametrů srovnatelných s jinými evropskými zeměmi.

Odvrácenou stranou dosažené vysoké detekční schopnosti systému s větším počtem vyhledávaných nemocí je však nárůst počtu opakování odběru SKK na filtrační papírek pro nejasný první výsledek. U většiny novorozenců se při opakovaném odběru zjistí fyziologické koncentrace analytů a původní abnormální nález se tak stává falešně pozitivním. Kumulativní hodnota FPR v období mezi 1. 1. 2010 až 31. 12. 2012 dosáhla 0,540 % pro všechny vyšetřené novorozence bez rozdílu porodní hmotnosti. Ve skupině novorozenců s porodní hmotností 2500 g a více činila 0,253 % a u novorozenců s nízkou porodní hmotností 3,421 %. Falešná pozitivita přináší jistou zátěž pro zdravou část populace a podle některých studií může zvyšovat stres u rodičů (viz článek Franková a kol. v tomto čísle, s. 87-94). FPR vzrůstá s klesající porodní hmotností (resp. zralostí). Je pravdou, že ve skupině nezralých novorozenců je zátěž a stigmatizace opakovaným odběrem SKK významně menší, protože se většinou jedná o děti na intenzivní péči, které jsou vyšetřovány i z jiných důvodů, ale snižování FPR je pro systém NS výzvou a cílem. Z tabulky 3 je zřejmě, že na falešné pozitivitě se z největší části (74 %) podílí NS CAH. Ostatní screenovaná onemocnění mají FPR významně nižší (např. všech 10 DMP jen okolo 0,1 %). Efektivní cestou ke snižování FPR je zavádění druhostupňových analytických metod, které se provádějí přímo v těch originálních SKK, ve kterých byl zjištěn zvýšený primární analyt. V případě CAH byl zkoušen průkaz alespoň jedné funkční kopie genu CYP21A2 pro 21-hydroxylázu. Tento přístup se nejeví použitelný pro běžnou praxi z důvodu velké pracnosti a finančních nákladů [16]. Slibné je profilování steroidů pomocí kapalinové chromatografie s následnou analýzou pomocí tandemové hmotnostní spektrometrie (LC--MS/MS), pilotní studie probíhají ve světě [17] i v ČR, zavedení této metody jako druhostupňové metody by mohlo podle pilotní studie v ČR snížit FPR pro CAH o cca 80–90 %.

V každém screeningovém programu existují také případy falešné negativity (FN), kdy pa-cienti (většinou s mírnějšími formami nemoci) nejsou screeningem zachyceni. Při NS CAH byly v průběhu sledovaného období zaznamenány dva případy, které unikly detekci NS. V jednom případě se jednalo o probanda s klinickým podezřením na CAH a léčeného kortikoidy již před odběrem SKK, tento případ tedy není faktickou FN, ale ve druhém případě se jednalo o skutečnou „biologickou“ FN u dívky s genotypem svědčícím pro solnou poruchu. Kauza byla podrobně analyzována a publikována [8]. Skutečná novorozenecká prevalence CAH po započítání FN činila 1:11 951. Detekci NS unikl i jeden pacient s MSUD, protože při konfirmačním vyšetření standardními technikami nebyly zjištěny zvýšené koncentrace diagnosticky významného analytu – alloisoleucinu, reálná novorozenecká prevalence pak vzroste na 1:120 884. Během NS CF bylo ve sledovaném období zaznamenáno 6 dětí, které unikly záchytu. Ve 3 případech se jednalo o pacienty, kteří se v novorozeneckém věku demonstrovali mekoniovým ileem (MI). Nejednalo se tedy o faktický únik diagnóze a nižší koncentrace IRT v případě MI jsou známé [18]. V dalším jednom případě se jednalo o skutečnou „biologickou“ FN s IRT pod „cut-off“ a u dvou novorozenců se jednalo o „analytickou“ FN, protože probandi měli dvě vzácné mutace, které nejsou ve spektru vyšetřovaných. Skutečná prevalence CF v naší kohortě novorozenců po započítání FN činila 1:6330. Populační riziko CF po započítání preimplantační a prenatální diagnostiky je však vyšší – cca 1:4500. NS CF lze významně zefektivnit pomocí dalšího analytického mezistupně – měření proteinu asociovaného s pankreatitidou [19].

Ze sledovaného období nemáme informaci o FN PKU/HPA. Screeningová prevalence PKU/HPA v období 1. 1. 2010 – 31. 12. 2012 byla vyšší (1:5867) než za celé sledované období (1:7234). Důvodem může být jednak fluktuace v důsledku relativně malého počtu vyšetřených novorozenců, ale také snížení hranice „cut-off“ pro fenylalanin z 240 na 120 µmol/l a zvýšenému záchytu lehčích forem HPA.

Sekundární non-PKU hyperfenylalaninemie způsobené poruchami metabolismu pterinů nejsou zahrnuty – v celém sledovaném období byl detekován 1 pacient s deficitem tetrahydrobiopterinu.

S technologickým pokrokem se rozšiřují analytické možnosti detekce stále většího počtu onemocnění ze SKK. Rozhodování, která onemocnění zahrnout do novorozeneckého screeningového programu, se stává stále složitější. V historických počátcích NS Wilson a Jungner stanovili rozhodovací kritéria o zařazování onemocnění do NS [20, 21]. Tato kritéria nebyla zpochybněna, ale jsou relativizována, např. hranice prevalence nebo ekonomická hranice (v ČR jsou náklady zdravotní pojišťovny na současný NS u jednoho novorozence 750 Kč). V diskusích se objevují i nová kritéria, jako např. ušetření jedince diagnostickému martyriu u vzácných chorob nebo informovaná reprodukce s možností prenatálního vyšetření či preimplantační diagnostiky u neléčitelných chorob.

S rozšiřováním NS se rozšiřují problémy nejen odborné, ale i etické, ekonomické a politické. Autoritativní stanovisko zaujala Americká společnost lékařské genetiky (ACMG), která po rozsáhlé studii a diskusi publikovala [22] seznam 55 chorob vhodných pro NS, které rozdělila na skupinu základní a na skupinu doplňkovou. Seznam, v USA chápán jako závazný, je uveden v tabulce 4 a postupně se v jednotlivých státech zavádí. Evropská síť odborníků v novorozeneckém screeningu (EUNENBS, European Network of Experts on Newborn Screening) provedla v letech 2010/2011 dotazníkovou studii a vydala [23] podobný seznam 26 onemocnění, které považuje za vhodné k zařazení do spektra NS v evropských státech. Seznam rozdělila na skupinu základní (potřebnou) s vysokou prevalencí, základní s nízkou prevalencí a skupinu kandidátní – viz tabulku 5.

Evropský panel je v současnosti vnímán méně závazně než americký a má charakter spíše „doporučení ke zvážení“. V ČR v současné době probíhá pilotní studie k rozšíření spektra dědičných metabolických poruch pomocí MS/MS a metodicky se připravuje studie NS těžké kombinované imunodeficience (SCID) [24].

ZÁVĚR

Rozšíření novorozeneckého screeningového programu v ČR zásadním způsobem zvýšilo efektivitu presymptomatického vyhledávání pacientů, neboť téměř dvaapůlkrát zvýšilo záchyt novorozenců s některou z vyhledávaných nemocí. Úroveň novorozeneckého screeningu v ČR odpovídá nyní standardu vyspělých států Evropské unie. NS v ČR je účinným nástrojem zkvalitnění péče o pacienty se vzácnými onemocněními a je vzorovým příkladem zlepšení přístupu zdravotnického systému k těmto pacientům. Další optimalizace systému NS jsou potřebné a jsou předmětem výzkumu – v současné době jsou vyvíjené druhostupňové metody s cílem snížit falešnou pozitivitu a hledají se možnosti k rozšíření spektra screenovaných chorob.

Práce vznikla za podpory: PRVOUK P31 pro FV¹ a P24 pro VK²; IGA MZ ČR NT/12213-3 a MZ ČR RVO-VFN64165/2012 pro VK²; MZOFNM2005, CZ.2.16/3.1.00/24022 a 00064203 pro MM⁵.

Došlo: 8. 1. 2014

Přijato: 14. 2. 2014

doc. MUDr. Felix Votava, Ph.D.

Klinika dětí a dorostu UK 3. lékařské fakulty

a FN Královské Vinohrady

Šrobárova 50

100 34 Praha 10

e-mail: votava@fnkv.cz