Probiotické kmeny v mateřském mléce – mýtus nebo skutečnost?

Probiotika a bioterapeutická agens jsou v posledních několika letech předmětem velkého medicínského zájmu. Klíčové pro složení střevní mikroflóry je zejména osídlení střeva bezprostředně po porodu. Za zdroj bakteriální kolonizace se považuje vaginální sliznice, střevní mikroflóra matky, nemocniční prostředí porodnice a v posledních několika letech i bakterie přítomné v mateřském mléce matky.

Na počátku 21. století se objevily první vědecké práce zkoumající potencionální probiotické vlastnosti bakteriálních kmenů izolovaných z mateřského mléka. V mateřském mléce jsou popisovány zejména stafylokoky, streptokoky, laktokoky, enterokoky, laktobacily a bifidobakterie. Některé z těchto kmenů mohou vykazovat probiotické vlastnosti. Přítomnost těchto bakterií v mateřském mléce je jistě vhodným polem pro další vědecké bádání, nicméně dosud jsou data velmi sporadická a neospravedlňují některá tvrzení o symbiotickém charakteru mateřského mléka a o klinickém benefitu těchto kmenů pro zdraví člověka v množství, ve kterém jsou v mléce přítomny. Nejistý je také původ těchto kmenů v mateřském mléce a jejich úloha v kolonizaci novorozence a utváření jeho střevní mikroflóry. Vzhledem k tomu, že mateřské mléko je zlatým standardem pro výživu kojence a tedy i vývoj kojeneckých formulí, je do budoucna nezbytné objasnění úlohy bakterií přítomných v mateřském mléce a jejich vztahu k prebiotickým oligosacharidům.

Klíčová slova:
mateřské mléko, probiotika, prebiotika, kolonizace, bakterie

Úvod

Probiotika a bioterapeutická agens jsou v posledních několika letech předmětem velkého medicínského zájmu. Výzkum je soustředěn zejména do klinických oblastí, jsou snahy definovat složení střevní mikroflóry člověka již od novorozeneckého období, je zkoumán vliv podávání probiotických léčiv i potravinových doplňků za různých klinických situací [1].

Je snaha využívat kmeny, které jsou přirozenou součástí bakteriálního osídlení člověka. V této souvislosti je považováno za klíčové složení střevní mikroflóry, kde je popisováno více než 1000 bakteriálních druhů. Důležité je zejména osídlení střeva bezprostředně po porodu, přičemž střevo plodu in utero je považováno za sterilní. Složení střevní mikroflóry fyziologického novorozence je již poměrně dobře známo, jsou popsány rozdíly v osídlení mezi dětmi porozenými vaginálně a císařským řezem. Za zdroj bakteriální kolonizace se považuje vaginální sliznice, střevní mikroflóra matky (v případě vaginálního porodu), případně nemocniční prostředí porodnice (ruce personálu apod.) zejména při porodu císařským řezem. V posledních několika letech se objevují také informace o tom, že zdrojem osídlení střeva novorozence mohou být bakterie přítomné v mateřském mléce matky. Mikroflóra kojených dětí se liší od dětí živených kojeneckými mléky [2].

Mateřské mléko savců bylo po dlouhou dobu považováno za sterilní, ovšem již před 30 lety byla popsána přítomnost bakterií v mateřském mléce člověka [3–6]. Tyto bakterie byly považovány za bakteriální kontaminaci a nálezům nebyla po dlouhou dobu věnována bližší pozornost. Bakteriální izoláty z mateřského mléka byly studovány téměř výhradně v souvislosti s mastitidou jako komplikací kojení. Až na počátku 21. století spolu s rozvojem zájmu o probiotika se objevily první vědecké práce zkoumající potencionální probiotické vlastnosti bakteriálních kmenů izolovaných z mateřského mléka. V mateřském mléce jsou popisovány zejména stafylokoky, streptokoky, laktokoky, enterokoky, laktobacily a bifidobakterie. Některé z těchto kmenů mohou vykazovat probiotické vlastnosti (některé druhy bifidobakterií, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum...).

Přehled literárních údajů

V roce 2003 zkoumali Heikkilä a Saris [7], zda jsou v mateřském mléce přítomny kmeny inhibující aktivitu nejčastějšího původce mastitidy a neonatálních infekcí – zlatého stafylokoka. Soustředili se zejména na anaerobní a fakultativně anaerobní kmeny. Ze 40 vzorků mateřského mléka bylo náhodně vybráno přes 500 izolátů. Kmeny zachycené kultivací byly identifikovány molekulárně genetickými metodami (PCR, RFLP, sekvenace 16S rRNA, RAPD). Mezi nimi byly identifikovány zejména komenzální stafylokoky (64 %) a orální streptokoky (30 %), zejména Staphylococcus epidermidis, Streptococcus salivarius a Streptococcus mitis. Ve 12,5 % byly prokázány bakterie mléčného kvašení a v 7,5 % enterokoky. Celkové množství kmenů v mléce nepřekračovalo 10⁴ CFU/ml (medián 10²). Některé z kmenů inhibovaly růst zlatého stafylokoka. Autoři považují za predominantní bakteriální druhy mateřského mléka komenzální stafylokoky a streptokoky. Tyto druhy byly již dříve identifikovány jako součást bakteriální flóry kojence [8–10]. Nejčastěji nacházeným druhem v mateřském mléce je Staphylococcus epidermidis, jenž je podle autorů do mléka přenesen kontaminací z okolní kůže prsu. Viridující streptokoky a alfa-hemolytický streptokok se běžně na kůži nevyskytují a do mléka jsou přeneseny pravděpodobně z úst novorozence, stejně jako řada dalších druhů osídlujících běžně ústní dutinu. Dva týdny po porodu byl v mléce zachycen také Lactobacillus crispatus, který je predominantním vaginálním laktobacilem zdravých žen. Autoři předpokládají, že do mléka mohl být přenesen od novorozence, který se kolonizoval při průchodu porodními cestami. Obdobný mechanismus byl dříve popsán u streptokoka skupiny B – GBS (Streptococcus agalactiae) [11].

Autoři dále předpokládají, že mateřské mléko je potenciálním zdrojem pro izolaci bioterapeutických agens (např. Lactobacillus rhamnosus GG) použitelných v prevenci závažných infekcí kojenců a mastitid kojících žen. Kojenec, který vypije 800 ml mateřského mléka denně, pozře v tomto objemu 8 x 10⁴ až 8 x 10⁶ komenzálních bakterií.

Ve stejném roce izolovala španělská skupina dr. Rodrígueze bakterie mléčného kvašení z mateřského mléka, areoly, kůže prsu a vaginy osmi kojících matek a z bukálních stěrů a stolice jejich kojených dětí [12]. Byly vykultivovány grampozitivní, kataláza negativní a oxidáza negativní tyčky a koky v množstvích 10³ až 10⁴ CFU v jednotlivých materiálech vyjma stolic kojenců, kde dosahovalo množství až 10⁸ CFU, a kůže prsu, kde bylo detekováno jen <20 CFU ze stěru. Náhodně vybrané kmeny byly podrobeny metodě RAPD--PCR a následnému sekvenování 16S rDNA. Shodný RAPD profil vykazovaly některé bakterie z mléka, areoly, bukální sliznice a stolic u jednotlivých párů matka-kojenec. Jako tyčka s takto shodným RAPD profilem byl identifikován Lactobacillus gasseri, mezi koky se jednalo o Enterococcus faecium. Izoláty z kůže prsu ani z vaginy nevykazovaly shodu v RAPD profilu s ostatními vzorky. Naopak některé izoláty vykazovaly shodný RAPD profil i přesto, že byly izolovány od různých párů matka-dítě.

Nebyly nalezeny významné rozdíly mezi osídlením kojence narozeného císařským řezem a ostatních kojenců narozených vaginálně. Autoři na základě těchto dat usuzují na synbiotické vlastnosti mateřského mléka a považují původ bakterií v něm obsažených za endogenní.

Stejná výzkumná skupina publikovala v roce 2006 práci popisující schopnost kmenů Lactobacillus gasseri a Lactobacillus coryniformis kolonizovat střevní lumen člověka [13] a v roce 2008 práci zabývající se potenciální úlohou Lactobacillus salivarius a Lactobacillus gasseri izolovaných z mateřského mléka v léčbě infekční mastitidy kojících žen [14]. Do studie bylo zařazeno 20 žen s infekční stafylokokovou mastitidou ve věku 26–34 let, u kterých nebylo onemocnění úspěšně zvládnuto podáváním antibiotik po dobu 2–4 týdnů. Za 2 týdny po poslední dávce antibiotik byly ženy randomizovány dvojitě zaslepeným způsobem na skupinu žen dostávajících placebo a na skupinu, které byly podávány výše uvedené probiotické kmeny – každý v denní dávce 10¹⁰ CFU. Oba kmeny byly dříve izolovány z mateřského mléka. Studie trvala 30 dnů. Po 2 týdnech podávání nebyly ve skupině s probiotiky pozorovány žádné známky mastitidy. Také množství stafylokoků zachycených u této skupiny po 4 týdnech bylo signifikantně nižší ve srovnání s kontrolní skupinou. U 6 z 10 žen v probiotické skupině byly z mléka vykultivovány podávané probiotické kmeny. Mechanismus tohoto osídlení spatřují autoři v tzv. „enteromamární cestě“, při níž laktobacily přítomné ve střevě matky procházejí přes střevní slizniční bariéru a jsou transportovány do mléčné žlázy prostřednictvím dendritických buněk [15, 16]. Kontroverzní je skutečnost, že na počátku studie nebyly ani v jedné ze skupin detekovány laktobacily i přesto, že v předchozích studiích stejné skupiny autorů [12, 17] byly laktobacily v mléce běžně nalézány a staly se zdrojem pro probiotika použitá léčebně v této studii. Autoři považují závěrem výše uvedená probiotika za vhodnou alternativu léčby stafylokokové mastitidy.

Další výzkumnou skupinu, která se zabývá potenciálně probiotickými kmeny mateřského mléka, tvoří prof. Erika Isolauri a spol. z finského Turku, kteří se systematicky věnují probiotikům zejména ve vztahu k alergiím [18, 19]. Tato skupina publikovala v roce 2007 práci popisující přítomnost bifidobakterií v mateřském mléce 20 matek metodou PCR a real-time PCR [20]. Nejčastěji nalezenými kmeny byly Bifidobacterium longum (100 %), dále pak Bifidobacterium animalis (74 %), Bifidobacterium bifidum (46 %) a Bifidobacterium catenulatum (33 %). Bifidobacterium breve a Bifidobacterium adolescentis byly přítomny pouze v 6 %. V každém vzorku bylo nalezeno průměrně 2,5 druhů bifidobakterií. Pomocí real-time PCR byly bifidobakterie detekovány v 17 ze 20 vzorků v množství 10²–10⁴ CFU. Koncentrace ani množství druhů nebyly odlišné u žen, které v průběhu studie konzumovaly probiotické produkty obsahující bifidobakterie. Podle autorů je určitá míra kontaminace při odběru vzorků mléka nevyhnutelná, proto nelze jednoznačně považovat mléko samotné za zdroj bifidobakterií. Proti kontaminaci z okolní kůže naopak svědčí fakt, že se jedná o striktně anaerobní mikroorganismy. V mléce byly identifikovány některé druhy bifidobakterií (např. Bifidobacterium animalis), které jsou ve stolici nalézány vzácně, proto autoři nepovažují střevní mikroflóru za primární zdroj kontaminace.

Autoři zdůrazňují význam časné kolonizace gastrointestinálního traktu kojence, mimo jiné také ve vztahu k teorii nutričního programování [21], podle níž lze skladbou časné výživy kojence ovlivnit riziko vzniku civilizačních chorob později v dospělosti. Je známo, že dominantním druhem střevní mikroflóry kojence v prvních týdnech života jsou právě bifidobakterie. Jejich růst je také podporován tzv. „bifidogenním faktorem“ – tedy prebiotickými oligosacharidy a dalšími složkami mateřského mléka, které pozitivně ovlivňují kolonizaci. Bifidobakterie jsou častou složkou probiotických kojeneckých formulí.

Stejná výzkumná skupina publikovala v roce 2007 práci popisující vztah mezi množstvím bifidobakterií detekovaných metodou PCR ve stolici 61 matek ve 30.–35. týdnu těhotenství, v mateřském mléku matek a stolici jejich kojenců 1 měsíc po porodu [22]. Důraz byl kladen na rozdíly mezi alergickými (s pozitivní anamnézou atopického ekzému, alergické rinitidy, astmatu či potravinové alergie; n = 53, z nich 37 mělo pozitivní alespoň jeden kožní prick test (PT)) a nealergickými matkami. Bifidobakterie byly detekovány ve všech vzorcích mateřského mléka (medián 1,4 x 10³ buněk/ml). Nejčastěji byl nalezen druh Bifidobacterium longum. Byla nalezena signifikantní korelace mezi výskytem Bifidobacterium adolescentis a Bifidobacterium bifidum u matek a jejich kojenců. Pouze děti alergických matek s pozitivním PT byly kolonizovány Bifidobacterium adolescentis. Tyto matky měly také signifikantně nižší množství bifidobakterií v mléce ve srovnání s nealergickými matkami a stejně tak tomu bylo ve stolici jejich dětí. Závěrem studie je uvedeno, že mateřské mléko obsahuje signifikantní množství bifidobakterií, ale jejich množství je ovlivněno alergií matky. Množství bifidobakterií v mléce a stolici matek má vliv na jejich množství ve stolici kojenců. Autoři považují mateřské mléko za významný zdroj bifidobakterií pro kojence.

V roce 2005 byla na sympoziu European Society for Pediatric Research prezentována švédská práce porovnávající pomocí kultivačních metod výskyt laktobacilů (zejména Lactobacillus reuteri) a bifidobakterií v mléce 226 matek z různých geografických oblastí [23]. Lactobacillus reuteri byl zachycen průměrně u 12 % matek (od 50 % u japonských a švédských venkovanek až po negativní vzorky od žen z městských oblastí Peru, Dánska a Izraele). Bifidobakterie byly nalezeny ve 100 % u japonských venkovanek a u 79 % žen z korejského venkova, zatímco vzorky ze stejných oblastí Dánska, Švédska a Peru byly negativní. Laktobacily byly nalezeny v 50 % vzorků z japonského, izraelského a korejského venkova, v mléce žen z izraelských, peruánských a dánských měst byla pozitivita pouze ve 20 %. Závěrem lze říci, že uvedené probiotické kmeny jsou častěji nalézány u žen z venkova, zejména japonských a korejských.

Diskuse a závěr

Je nepochybné, že mateřské mléko obsahuje široké spektrum bakterií. V odborných publikacích stojí proti sobě několik názorů na jejich původ – od teorie kontaminace z okolní kůže či úst kojence až po patofyziologické teorie transportu bakterií krevním řečištěm. Zajímavé je i tvrzení, že mléko je zdrojem probiotických bakterií, protože byl nalezen druh Bifidobacterium animalis. Tento druh sice nebyl zprvu nalézan v lidské stolici, ale v posledních letech se masivně přidává do jogurtů a proto bývá izolován u lidí častěji.

Některé analýzy jsou založeny na molekulárně genetických metodách, které nemusí nutně prokazovat živé bakterie, ale pouze jejich fragmenty. Metoda RAPD poskytuje velké množství dat, a proto je při formulaci závěrů na jejím podkladě nutné dbát zvýšené obezřetnosti. Sami autoři připouštějí shodu některých kmenů ve vzorcích od různých párů matka-dítě. U této metody (stejně jako u PCR) jsou možné jak falešně negativní (PCR inhibitory), tak falešně pozitivní (jiný než bakteriální genetický materiál ve vzorcích) výsledky. Proto je vhodné tyto testy doplňovat i kultivačními technikami – tj. stanovením živých buněk.

Výše uvedené studie se také liší v prevalenci kmenů přítomných v mateřském mléce. Zdá se, že zcela převažující jsou komenzální stafylokoky a streptokoky, které jsou běžnou součástí kožní a slizniční mikroflóry člověka. Přežití stafylokoků v prostředí mateřského mléka je dáno do značné míry rezistencí na lyzozym, která je u tohoto druhu častá (zejména u Staphylococcus aureus).

Lze tedy říci, že přítomnost bakterií s potencionálně probiotickými vlastnostmi v mateřském mléce je jistě vhodným polem pro další vědecké bádání, nicméně dosud jsou data velmi sporadická a neospravedlňují některá tvrzení o symbiotickém charakteru mateřského mléka a o klinickém benefitu těchto kmenů pro zdraví člověka v množství, ve kterém jsou v mléce přítomny. Nejistý je také původ těchto kmenů v mateřském mléce a jejich úloha v kolonizaci novorozence a utváření jeho střevní mikroflóry. Některé práce naopak připouštějí možnost kontaminace matky ze sliznic kojence.

Vzhledem k tomu, že mateřské mléko je zlatým standardem pro výživu kojence a tedy i vývoj kojeneckých formulí, je do budoucna nezbytné objasnění úlohy bakterií přítomných v mateřském mléce a jejich vztahu k prebiotickým oligosacharidům, které podporují růst zejména bifidobakterií a laktobacilů.

Práce byla podpořena grantem IGA MZ NR/8310-5 a VZ 64203/6903.

Seznam použitých zkratek:

PCR – polymerázová řetězová reakce

RFLP – polymorfismus délky restrikčních fragmentů

RAPD – náhodně amplifikovaná polymorfní DNA

CFU – jednotka formující kolonie

rRNA – ribosomální RNA

GBS – streptokok skupiny B (Streptococcus agalactiae)

Došlo: 1. 4. 2009

Přijato. 10. 9. 2009

MUDr. Jiří Bronský, Ph.D.

Pediatrická klinika UK 2. LF

FN Motol

V Úvalu 84

150 06 Praha 5

e-mail: bronsky@email.cz

Redakční poznámka: Kontrolní otázky k tomuto článku jsou uveřejněny na vložené příloze v tomto čísle.