Vztah solubilních faktorů imunitního systému k fenotypu idiopatických zánětlivých myopatií

Úvod.
Idiopatické zánětlivé myopatie (myozitidy, IIM), představují heterogenní skupinu vzácných autoimunitních systémových onemocnění, společně charakterizovaných zejména svalovou slabostí, postihující převážně proximální skupiny příčně pruhovaného svalstva. Heterogenita myozitid je více než v klinickém obraze vyjádřena v jejich patogenetických mechanismech a odráží se v imunofenotypové odpovědi u jednotlivých podtypů.

Cíle práce.
Cílem této práce bylo popsat asociace a vliv solubilních faktorů imunitního systému, přítomných v sérech pacientů s IIM, s fenotypovými charakteristikami myozitid a jejich podtypů, ověřit případnou expresi těchto molekul v zánětlivě změněné svalové tkáni pacientů a zhodnotit jejich význam v patogenezi analýzou jejich působení na imunitní a svalové buňky in vitro.

Výsledky.
Popsali jsme prevalenci a charakteristiku kloubního postižení u pacientů s myozitidou a jeho významnou asociaci s anti-Jo-1 autoprotilátkou. Dále jsme potvrdili vztah anti-HMGCR protilátky k imunitně zprostředkované nekrotizující myopatii, její těsný vztah k předchozí léčbě statiny a recentní nárůst incidence. Prokázali jsme překvapivou negativní asociaci hladin IFNα s aktivitou svalového postižení na magnetické rezonanci, avšak popisujeme korelaci klinické aktivity onemocnění s aktivací dráhy interferonu typu I u pacientů s dermatomyozitidou. Dále jsme prokázali korelaci hladin resistinu a klinické aktivity a hladin visfatinu s klinickou aktivitou u anti-Jo-1 pozitivních pacientů. Resistin i visfatin jsou zvýšeně exprimované ve svalové tkáni pacientů s IIM. Navíc prokazujeme odlišnou specifickou expresi některých miRNA v sérech pacientů s PM a DM. Séra pacientů s IIM jsou schopna aktivace dráhy interferonu typu I in vitro a tato aktivace je zprostředkována především IFNα. Taktéž prokazujeme schopnost resistinu indukovat expresi prozánětlivých cytokinů (IL-1β, IL-6, MCP-1) v mononukleárních buňkách.

Závěr.
Naše výsledky ukazují na vztah jednotlivých molekul imunitního systému k jednotlivým podtypům či fenotypovým projevům IIM a demonstrují jejich význam v patogenezi tohoto onemocnění.

Klíčová slova:
Idiopatické zánětlivé myopatie, solubilní faktory imunitního systému

1 Úvod

Idiopatické zánětlivé myopatie (IIM) jsou heterogenní skupinou vzácných systémových autoimunitních onemocnění neznámé etiologie. Jejich společným projevem je progredující svalová slabost příčně pruhovaného svalstva, postihující zejména proximální svalové skupiny (proximální a pletencové svaly horních a dolních končetin, polykací svaly, svalstvo krku, eventuálně i dýchací svaly), snížená výkonnost svalů a zvýšená svalová únavnost. Velmi časté je postižení dalších orgánů nebo orgánových soustav, nejčastěji plic, kůže, gastrointestinálního traktu a kloubů (Dalakas, M.C., 1991, Dalakas, M.C. and Hohlfeld, R., 2003).

1.1 Epidemiologie, klasifikace a etiologie

Roční incidence myozitid je odhadována na 2–10 na milion obyvatel, roční prevalence se pak pohybuje okolo 20/100 000 obyvatel (Dalakas, M.C. and Hohlfeld, R., 2003), celkový poměr incidence u žen a mužů je asi 2,5:1.

Hlavními zástupci skupiny idiopatických zánětlivých myopatií jsou polymyozitida (PM), dermatomyozitida (DM), juvenilní dermatomyozitida (JDM), myozitida s inkluzními tělísky (IBM), imunitně zprostředkovaná nekrotizující myopatie (immune mediated necrotizing myopathy, IMNM), popřípadě myozitida asociovaná s maligním onemocněním (cancer associated myositis, CAM).

V etiologii idiopatických zánětlivých myopatií se pravděpodobně uplatňují jak faktory genetické, tak i vlivy vnějšího prostředí, jako např. UV záření (Burd, C.J. et al., 2008) nebo statiny (Christopher-Stine, L. et al., 2010, Mammen, A.L. et al., 2011), jejich podíl, popřípadě vzájemné interakce však nejsou dosud uspokojivě objasněny.

1.2 Patogeneze

Patogeneze autoimunitních myopatií není v současné době zcela jasná; předpokládá se kombinace imunitních a neimunitních mechanismů ve vývoji chronického zánětu v kosterním svalstvu a hlavních klinických symptomů – svalové slabosti a únavnosti: přímý, zejména cytotoxický efekt infiltrujících leukocytů, zejména T-lymfocytů a makrofágů na svalové buňky, dále nepřímý efekt molekul imunitního systémů (autoprotilátek, molekul MHC, cytokinů, chemokinů a dalších) a konečně alterace metabolismu, zejména prostřednictvím poškození mikrocirkulace (Hochberg, M.C., 2011).

1.2.1 Buněčná imunopatologie

Zánětlivá celulární infiltrace kosterního svalu se vyskytuje ve dvou hlavních vzorcích: predominantně endomyziální lokalizaci, sestávající se zejména z CD8⁺ a CD4⁺ T-lymfocytů, makrofágů a dendritických buněk, které obkružují a někdy i invadují do ne-nekrotických svalových vláken u polymyozitidy (Dalakas, M.C., 1991, Page, G. et al., 2004, Plotz, P.H. et al., 1995) a v druhém případě se jedná převážně o CD4⁺ T-buňky, makrofágy, dendritické buňky a B-lymfocyty v perivaskulární a perimyziální lokalizaci a je pozorován zejména u dermatomyozitidy (Dalakas, M.C., 1991, Page, G. et al., 2004, Plotz, P.H. et al., 1995).

1.2.2 Autoprotilátky

Sérové autoprotilátky jsou nalézány u většiny pa-cientů s autoimunitními myopatiemi; pozitivita antinukleárních nebo anticytoplazmatických protilátek se vyskytuje mezi 55–80 % nemocných (Targoff, I.N., 2002). Identifikace autoprotilátek přispívá ke klasifikaci jednotlivých podtypů myozitid, asociaci s klinickými syndromy a specifickým orgánovým postižením a v predikci prognózy základního onemocnění (Betteridge, Z. and McHugh, N., 2015, Ghirardello, A. et al., 2014, Gunawardena, H. et al., 2009, Troyanov, Y. et al., 2005). Protilátky, které mohou být přítomny i u jiných autoimunitních onemocnění, jsou označovány jako protilátky asociované s myozitidou (myozitis-associated autoantibodies, MAA), například (anti-RNP), anti-PM-Scl a anti-Ku nebo anti-Ro52 a Ro60 (Targoff, I.N., 2002).

Autoprotilátky vyskytující se pouze u IIM jsou nazývány protilátkami specifickými pro myozitidu (myozitis-specific autoantibodies, MSA). Do této skupiny jsou řazeny tzv. antisyntetázové protilátky (anti-Jo-1, -PL-7, -PL-12, -EJ, -OJ, -KS, -Zo, -Ha), anti-SRP, anti-Mi-2, anti-TIF1γ, anti-CADM-140, anti-MDA5, anti-NXP2) a anti-cNA1 (Betteridge, Z. et al., 2007, Betteridge, Z. and McHugh, N., 2015, Cruellas, M.G. et al., 2013, Targoff, I.N., 2002). Specifickou protilátkou je pak anti-HMGCR, s antigenem 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA-reduktázou, vyskytující se u pacientů se statiny indukovanou imunitně zprostředkovanou nekrotizující myopatií (Christopher-Stine, L. et al., 2010, Mammen, A.L. et al., 2011).

Patogenetický význam autoprotilátek u myozitid není dosud jasný, a to ani v otázce, proč dochází k jejich produkci, ani zda mají přímý (etio)patogenetický účinek v onemocnění. Fenotyp pacientů s antisyntetázovými autoprotilátkami se liší na míře postižení svalů (myozitida jako taková) a plic (intersticiální fibróza) v závislosti na přítomnosti konkrétní antisyntetázové protilátky (Marie, I. et al., 2012), imunitně zprostředkovaná nekrotizující myopatie je asociovaná s anti-SRP a anti-HMGCR protilátkami (Christopher-Stine, L. et al., 2010, Kao, A.H. et al., 2004, Mammen, A.L. et al., 2011, Targoff, I.N. et al., 1990).

1.2.3 Cytokiny a chemokiny

Z dalších solubilních molekul imunitního systému je velký význam připisován cytokinům a chemokinům. Z nich je v současnosti nejvíce věnována pozornost interferonu typu I: sérové hladiny IFN-α jsou vyšší u dermatomyozitických pacientů oproti zdravým kontrolám a inverzně korelují s délkou neléčeného onemocnění (Niewold, T.B. et al., 2009), proti očekávání ale jeho sérové hladiny nekorelují s aktivitou onemocnění (Krol, P. et al., 2011). IFN typu I jsou silnými induktory exprese MHC molekul I a II třídy (Tournadre, A. et al., 2012), v periferních leukocytech i svalové tkáni myozitických pacientů byly nalezeny zvýšené exprese genů indukovatelných interferonem typu I (tzv. IFN I signature) (Walsh, R.J. et al., 2007).

Další cytokiny, u kterých se přepokládá účast na patogenezi IIM, zahrnují rodinu interleukin 1 (IL-1) (Dorph, C. et al., 2006, Lepidi, H. et al., 1998, Tews, D.S. and Goebel, H.H., 1996), TGF-β (Moran, E.M. and Mastaglia, F.L., 2014) a pravděpodobně i TNF-α (Dastmalchi, M. et al., 2008, Hengstman, G.J. et al., 2008).

Z chemokinů jsou u IIM pozorovány zvýšené exprese jak α-chemokinů (CXCL9 a CXCL10), tak β-chemokinů (CCL2, CCL3, CCL4, CCL19 a CCL21) (Baird, G.S. and Montine, T.J., 2008, De Paepe, B. et al., 2007, Marino, M. et al., 2008, Schmidt, J. et al., 2008).

1.2.4 Neimunitní mechanismy

Mezi neimunitní mechanismy s potenciálním patogenetickým působením můžeme zařadit jednak tkáňovou hypoxii: svalová slabost bez přítomnosti zánětlivého infiltrátu či ztráta kapilár ve svalech (Emslie-Smith, A.M. and Engel, A.G., 1990, Estruch, R. et al., 1992) a zvýšená exprese hypoxií inducibilního faktoru 1-α (HIF-1-α), včetně následků jeho působení (Dastmalchi, M. et al., 2008, Probst-Cousin, S. et al., 2010); dále stres endoplazmatického retikula (Nagaraju, K. et al., 2005) (Nagaraju, K. et al., 2005), autofagii, a to zejména u IBM (Nagaraju, K. et al., 2000) a konečně poruchy metabolismu, které se pravděpodobně mohou uplatňovat při statiny indukované nekrotizující myopatii, což bylo dokumentováno na myších modelech (Osaki, Y. et al., 2015).

2 Hypotéza a cíle práce

Hypotéza této disertační práce vycházela z předpokladu, že sérové solubilní faktory, jako jsou prozánětlivé cytokiny a chemokiny, autoprotilátky atd., produkované organismem pacientů nemocných IIM, mohou ovlivňovat chování svalových buněk vyvoláním morfologických změn, změn v expresi molekul MHC-I, expresi autoantigenů, změn produkce cytokinů, chemokinů či adhezivních a kostimulačních molekul v jejich kvalitě i kvantitě, aktivace procesů vedoucích k apoptóze nebo nekróze atd., které následně vedou ke klinickým projevům IIM. Zamýšleli jsme pokusit se objasnit případný vliv těchto solubilních faktorů vyvoláním uvedených změn jejich působením na normální svalové buňky v tkáňových kulturách, vytvořením simulovaného prostředí IIM a analýzou produktů zánětlivé tkáně. V průběhu experimentů jsme často naráželi na technické a metodologické obtíže, zejména při kultivaci svalových buněk, proto jsme naši hypotézu rozšířili o klinickou úroveň a rozšířili jsme práci o analýzu fenotypových projevů u IIM a jejich podtypů ve vztahu ke konkrétním faktorům imunitního systému. Předpokládáme tedy, že tyto solubilní faktory imunitního systému mají vliv na konkrétní fenotyp onemocnění na molekulární, buněčné, i klinické úrovni. Dále předpokládáme, že heterogenita onemocnění ze skupiny IIM má svůj korelát v odlišném složení molekul imunitního systému.

Cílem této disertační práce je popsat asociace solubilních faktorů s jednotlivými subtypy IIM a manifestacemi klinických symptomů a pokusit se objasnit případný vliv těchto faktorů na patogenezi onemocnění jejich působením na kultivované svalové a imunitní buňky v tkáňové kultuře:

1. Analyzovat klinické fenotypy a symptomy v kohortě pacientů s idiopatickými zánětlivými myopatiemi a tyto asociovat s přítomností solubilních faktorů (cytokiny, chemokiny, autoprotilátky) v sérech pacientů.
2. Ověřit případnou expresi těchto faktorů a její význam ve svalové tkáni pacientů s IIM.
3. Zhodnotit vliv solubilních sérových faktorů na svalové buňky a leukocyty periferní krve in vitro.

3 Materiál a metodika (komentáře k publikacím zařazeným do disertační práce).

3.1 Artritida u idiopatických zánětlivých myopatií: klinické charakteristiky a asociace s autoprotilátkami.

(Klein M, et al. Arthritis in Idiopathic Inflam-matory Myopathy: Clinical Features and Auto-antibody Associations. J Rheumatol 2014; 41(6): 1133–9.)

Pacienti. Do studie bylo zařazeno 106 konsekutivních pacientů s IIM vyšetřených v Revmatologickém ústavu (RÚ) mezi lednem a zářím 2012. Všichni pacienti splnili příslušná kritéria onemocnění a podstoupili svalovou biopsii. Kontrolní skupina pro genetickou analýzu byla tvořena 176 zdravými jedinci. U všech pacientů byl fyzikálním vyšetřením stanoven 68/66 kloubní index. Anamnestické údaje o základním onemocnění a kloubních projevech byly získány kombinací osobního dotazování a pátrání v dostupné zdravotnické dokumentaci RÚ.

Autoprotilátky. Autoprotilátkové profily byly získány pomocí rutinních testů laboratoří RÚ (anti- Jo-1, Mi-2, Ku, PM-Scl75, PM-Sc100, PL-7, PL-12, EJ, OJ, SRP, Ro, Ro52, La, Scl-70, U1-RNP, CCP, RF, ACPA) a dále in-house ³⁵S radioimunoprecipitací pro detekci a potvrzení autoprotilátek nedetekovatelných komerčními testy (anti- TIF1-γ, MDA5, NXP2, Zo, EIF, RNAP I, II a III).

HLA typizace. Alelické polymorfismy HLA-DRB1 a HLA-DQB1 jsme analyzovali DNA-based typizací za pomoci komerčních testů (OneLambda).

Statistika. Data byla zpracována za pomoci standardních popisných a statistických testů (Mann-Whitney test, Fisherův test).

3.2 Stoupající incidence imunitně zprostředkované nekrotizující myopatie: zkušenosti z jednoho centra

(Klein M, et al. Increasing Incidence of Immune Mediated Necrotizing Myopathy – Single Centre Experience. Rheumatology (Oxford) 2015; 54(11): 2010–4.)

Pacienti. Do studie byli zařazeni 233 pacienti, kteří splňovali kritéria pro idiopatické zánětlivé myopatie. Klinická data a údaje o užívání statinů jsme získali z dostupné dokumentace RÚ.

Biopsie. Retrospektivně jsme reevaluovali výsledky svalových biopsií 357 pacientů, provedených během let 2004–2014. Biopsie byly prováděny z di-agnostických důvodů ve FN Motol, byly odebírány z m. vastus lateralis a byly všechny odečítány jedním hodnotitelem.

Autoprotilátky. Pro autoprotilátkové profily jsme použili výsledky rutinně prováděných vyšetření. Anti-HMGCR protilátky byly měřeny metodou ELISA.

Statistika. Demografická data, klinické charakteristiky a výsledky jsme prezentovali pomocí popisné statistiky. Kategoriální data byla analyzována prostřednictvím chí-kvadrát testu a Fischerova testu.

3.3 Zvýšené hodnoty visfatinu jsou asociované s vyšší aktivitou nemoci u anti-Jo-1 pozitivních pacientů s myozitidou

(Hulejová H, Klein M, et al. Increased visfatin levels are associated with higher disease activity in anti-Jo-1-positive myozitis patients. Clin Exp Rheumatol 2016; 34(2): 222–9.)

Pacienti. Do studie bylo zařazeno 38 anti-Jo-1 pozitivních pacientů s IIM, sledovaných v RÚ. Všichni pacienti splnili kritéria dle Bohana a Petera. Kontrolní skupina byla tvořena 35 věkem a pohlavím odpovídajících zdravých dobrovolníků. Subjektům bylo odebráno sérum, u 16 pacientů byly k dispozici longitudinální vzorky. Klinická data jsou aktuální k datu odběru séra.

Laboratorní měření. Sérové hladiny kreatinkinázy (CK), myoglobinu (Mb), laktátdehydrogenázy (LDH) a C-reaktivního proteinu (CRP) byly stanoveny v rámci rutinních vyšetření. Hladiny visfatinu jsme měřili metodou ELISA.

Imunohistochemie. Na pěti vzorcích od pacientů s polymyozitidou a pěti od pacientů s dermatomyozitidou, odebraných před zahájením léčby jsme po přípravě preparátů provedli barvení na visfatin. Exprese visfatinu byla hodnocena semikvantitativně na 7 lokusech (zánětlivý infiltrát, perimy-ziální cévy, endomyziální kapiláry, svalová vlákna, atrofická svalová vlákna a oblasti rhabdomyolýzy).

Statistika. Statistickou analýzy jsme provedli za použití Kruskal-Wallisova testu, Mann-Whitneyova testu a párového t-testu. Spearmanovu analýzu jsme použili pro výpočet korelací. Kontingenční tabulky byly analyzovány prostřednictvím Fischerova testu.

3.4 Resistin u idiopatických zánětlivých myopatií

(Filková M, Klein M, et al. Resistin in idiopathic inflammatory myopathies. Arthritis Res Ther 2012; 14(3): R111.)

Pacienti. Do studie bylo zařazeno 42 pacientů s IIM (17 pacientů s DM a 25 s ostatními typy myozitid) a 27 zdravých kontrol. Všichni pacienti podstoupili svalovou biopsii. Klinická aktivita byla stanovena pomocí skóre MYOACT, svalovou sílu jsme hodnotili manuálním svalovým testem.

Laboratorní data. Od všech pacientů jsme získali vzorky periferní krve. Hodnoty CRP, CK a Mb byly stanoveny rutinně. Sérové hladiny resitinu, MCP-1, IL-1β, IL-6 a TNFα jsme stanovili pomocí metodou ELISA.

Imunohistochemie. Vzorky svalu od pacientů s DM (n = 5) a jinou myozitidou (n = 5) jsme získali při diagnostické biopsii. Jako kontrolu jsme použili vzorky pacientů s nezánětlivým svalovým onemocněním (myasthenia gravis, n = 5). Provedli jsme barvení na resistin, jeho expresi jsme hodnotili semikvantitativně.

Buněčné kultury a stimulační experimenty. Komerčně dostupné lidské buňky kosterní svaloviny jsme kultivovali v DMEM médiu. Mononukleární buňky periferní krve (PBMC) jsme izolovali de novo od zdravých kontrol. Jak myocyty, tak PBMC jsme stimulovali rekombinantním resistinem po dobu 6 a 48 hodin.

RNA izolace a RT-PCR. Celková RNA byla izolována pomocí MagNA Pure Compact RNA Isolation kitu. cDNA jsme získali reverzní transkripcí a relativní expresi jsme stanovili pomocí Fast Real-Time PCR. Jako endogenní kontrolu jsme použili expresi 18S.

Proliferační assay. Proliferaci myocytů po 72hodinové stimulaci resistinem jsme vyhodnotili pomocí dimethyl-thiazolového (MTT) testu.

Statistika. Použili jsme deskriptivní statistické metody, Mann-Whitneyův, Kruskal-Wallisův a párový T-test. Pro vyjádření korelace jsme použili Spearmanův a Pearsonův korelační koeficient.

3.5 Sérové hladiny interferonu α u pacientů s dermato-myozitidou/polymyozitidou nekorelují s aktivitou onemocnění

(Król P, Klein M, et al. Serum levels of interferon α do not correlate with disease activity in patients with dermatomyozitis/polymyozitis. Ann Rheum Dis 2011; 70(5): 879–80.)

Pacienti. Do studie bylo zařazeno 43 pacientů s DM (n = 24) a PM (n = 19). Všichni pacienti měli provedenou magnetickou rezonanci (MRI) stehenních svalů, údaje o jejich léčbě jsme získali ze zdravotnické dokumentace. Klinická aktivita nemoci byla hodnocena pomocí škály MOYACT. Při hodnocení aktivity nemoci na MRI jsme posuzovali rozsah, intenzitu a celkové postižení pomocí VAS. Kontrolní skupina byla tvořena 25 zdravými dobrovolníky a 6 pozitivními kontrolami s akutní virovou infekcí.

Laboratorní data. Sérové hladiny IFNα jsme stanovili metodou mikročásticové eseje FlowCytomix. Anti-Jo-1 autoprotilátky jsme detekovali line-blot esejem.

Statistika. Použili jsme deskriptivní statistické metody a Mann-Whitneyův test.

3.6 Autoprotilátkové specificity a aktivace dráhy interferonu typu I u idiopatických zánětlivých myopatií.

(Ekholm L, Klein M, et al. Autoantibody specificities and type I interferon pathway activation in Idiopathic Inflammatory Myopathies. Scan J Immunol. Accepted 8.5.2016. doi: 10.1111/sji.12449.)

Pacienti. Kohortu 37 pacientů tvořilo 18 pacientů s PM a 19 s DM ze dvou center (Rheumatologie avdelning, Karolinska Sjukhuset, Stockholm, Švédsko a Revmatologický ústav, Praha). Do studie nebyli zařazeni pacienti s překryvným syndromem, na léčbě biologickými preparáty a s neznámým statusem antinukleárních protilátek. Srovnávací skupinu tvořilo 47 pacientů se systémovým lupusem.

Klinická aktivita nemoci byla hodnocena pomocí skóre MYOACT. Hodnoty sérových hladin CK, ALT, AST a LDH a detekce antinukleárních protilátek byly stanoveny při rutinních vyšetřeních. Autoprotilátky specifické pro myozitidu byly detekovány pomocí line-blot imunoesejů a výsledky byly potvrzeny prostřednictvím imunoprecipitace.

IFN signatura v plné krvi. Z plné krve jsme izolovali celkovou RNA; po přepisu reverzní transkripcí do cDNA jsme stanovili relativní kvantity 8 určených genů (IFI3, IFIT2, MxA, IFI44L, HERC5, IFIT1, RSAD2 a OAS3 metodou RT-PCR.

Interferonem regulovaný indukční esej. PBMC od zdravých dárců byly stimulovány séry pacientů bez nebo v přítomnosti neutralizačních protilátek proti IFN-α, resp. proti receptoru pro IFN-α. V PBMC jsme měřili indukci genové exprese, jak je popsáno výše.

Genotypizace. Alelické polymorfismy HLA-DRB1 a HLA-DQB1 jsme analyzovali pomocí komerčních setů (OneLambda, DR low-resolution kit).

Statistika. Použili jsme metody popisné statistiky, Mann-Whitneyův a t-test, Fischerův a Pearsonův chí-kvadrát test.

3.7 Mikroaray-analýza cirkulující mikro RNA v sérech pacientů s polymyozitidou a dermatomyozitidou vykazuje odlišný expresní profil a je asociován s aktivitou onemocnění

(Mišunová M, Klein M, et al. Microarray analysis of circulating micro RNAs in the serum of patients with polymyozitis and dermatomyozitis reveals a distinct disease expression profile and is associated with disease activity. Clin Exp Rheumatol 2016; 34(1): 17–24.)

Pacienti. Do studie bylo zařazeno 28 pacientů s PM a DM, splňujících kritéria pro IIM dle Bohana a Petera. Kontrolní skupinu tvořilo 16 zdravých jedinců a 16 pacientů se systémovým lupusem. Aktivita nemoci byla hodnocena za použití vizuální analogové škály (Physician’s Global Assesment. Pro účely této studie byli pacienti rozděleni na nízce a vysoce aktivní (hranice 40).

Detekce specifických miRNA. Celkovou RNA jsme izolovali z periferní krve metodou trizol fenol-chloroformové extrakce. Exprese miRNA jsme měřili pomocí single-chanel platform high density human miRNA array (Agilent Technologies).

Statistika. Statistická analýza miRNA expresí byla stanovena pomocí softwaru Arraystar. Pro srovnání diferenciální exprese jsme použili t-test.

4 Výsledky (komentáře k publikacím zařazeným do disertační práce)

4.1 Artritida u idiopatických zánětlivých myopatií: klinické charakteristiky a asociace s autoprotilátkami

Artritida se kdykoli během průběhu základního onemocnění objevila u 56 (53 %) pacientů: u 39 (37 %) byla přítomna na začátku svalového onemocnění, včetně 23 případů (22 %), kdy svalovým příznakům předcházela. V době klinického vyšetření byl u 31 (29 %) pacientů přítomen alespoň 1 oteklý kloub. Nejčastěji postižené kloubní oblasti byly zápěstí, metakarpofalangeální a proximální interfalangeální klouby. Myozitida kdykoli během průběhu onemocnění relabovala u 31 pacientů a artritida byla jedním z projevů relapsu u 15 pacientů (48,8 %), nejčastěji se vyskytla současně s ostatními symptomy. Přítomnost artritidy na začátku onemocnění však nebyla prediktivní pro přítomnost artritidy při relapsu myozitidy a stejně tak přítomnost artritidy v počátku onemocnění nebyla prediktivní pro to, zda případný relaps myozitidy bude nebo nebude doprovázen artritidou. Z dostupných rentgenových snímků (47 pacientů) pouze u 2 pacientů jsme identifikovali kloubní eroze: jeden pacient trpěl překryvným syndromem s revmatoidní artritidou a druhý byl pozitivně testován na anti-Jo-1 autoprotilátku. 27 z 29 pacientů s pozitivitou anti-Jo-1 mělo artritidu kdykoli v průběhu IIM; tato prevalence je signifikantně vyšší v porovnání anti-Jo-1 negativními pacienty (p < 0,0001). Nenalezli jsme žádnou asociaci artritidy s jednotlivými HLA alelami.

4.2 Stoupající incidence imunitně zprostředkované nekrotizující myopatie: zkušenosti z jednoho centra

Z 357 pacientů bioptovaných ve sledovaném období jich 233 splnilo kritéria pro některou z idiopatických zánětlivých myopatií, včetně 27 (11,6 %) IMNM. Nikdo z nich nebyl diagnostikován mezi lety 2004 až 2007, v období 2008-2011 se vyskytovaly 2-3 nové případy ročně; mezi lety 2012-2014 došlo k významnému nárůstu incidence na 18 případů (p < 0,0001). 13 z 27 pacientů (48 %) mělo pozitivní farmakoanamnézu užívání statinů, u 11 z nich (58 %) byly přítomny anti-HMGCR autoprotilátky. U 4 (14,8 %) pacientů jsme zjistili přítomnost anti-SRP autoprotilátky, 3 (11,1 %) byli anti-Jo-1 pozitivní, z ostatních autprotilátek asociovaných s IIM jsme identifikovali pozitivitu pro antinukleární protilátky (ANA) (6x), anti-Ro (2x), anti-La (1x) a anti-Ku (1x). U 2 pacientů jsme neprokázali přítomnost žádné známé autoprotilátky. Neidentifikovali jsme žádného pacienta bez předchozího užívání statinů, který by byl anti-HMGCR pozitivní. Kromě anti-HMGCR protilátek a anamnézy užívání statinů jsme neprokázali asociaci IMNM s žádným demografickým, klinickým, laboratorním nebo jiným environmentálním faktorem.

4.3 Zvýšené hodnoty visfatinu jsou asociované s vyšší aktivitou nemoci u anti-Jo-1 pozitivních pacientů s myozitidou

Sérové hladiny visfatinu a BAFF byly signifikantně vyšší u pacientů s myozitidou než u zdravých kontrol (visfatin: 1,94 [0,13 – 9,86] vs. 1,51 [0,14–5,20] ng/ml; p < 0,05) a byly asociovány s klinickou aktivitou svalového postižení hodnocenou pomocí VAS (visfatin rs = 0,39, p = 0,02; BAFF rs = 0,34, p = 0,04). Sérové hladiny BAFF pozitivně korelovaly s koncentracemi svalových enzymů (Mb rs = 0,57, p = 0,002, CK rs = 0,51, p = 0,001) a anti-Jo-1 protilátek (rs = 0,85, p = 0,001); tento vztah jsme však neprokázali u visfatinu mimo korelace s LDH (rs = 0,28, p = 0,02). Dále jsme pozorovali pozitivní korelaci mezi sérovými hladinami BAFF a visfatinu (rs = 0,44, p=0,01), naopak u zdravých jedinců byla tato korelace negativní (rs = - 0,37, p = 0,03). Neprokázali jsme rozdíly mezi hladinami visfatinu na základě stáří nebo pohlaví pacientů, době trvání nemoci nebo na délce léčby glukokortikoidy. U pacientů s myozitidou byla, na rozdíl od kontrolních pacientů s myasthenií gravis, přítomna zvýšená exprese visfatinu ve svalové tkáni v endomyziálních a perimyziálních infiltrátech.

4.4 Resistin u idiopatických zánětlivých myopatií

U pacientů s IIM jsme nalezli signifikantně vyšší hladiny sérového resistinu než u kontrol (8,53 ± 6,84 vs. 4,54 ± 1,08 ng/ml, p < 0,0001) a tyto korelovaly s CRP (r = 0,328, p = 0,044) a s vizuální analogovou škálou hodnocení aktivity myozitidy (MYOACT) (r = 0,382, p = 0,026). U anti-Jo-1 pozitivních pacientů jsme pozorovali silnější asociaci hladin resistinu s CRP (r = 0,717, p = 0,037), tak s hodnotami MYOACT (r = 0,798, p = 0,0007) a také jsme pozorovali trend ke korelaci s hladinami myoglobinu. U pacientů s dermatomyozitidou signifikantně korelovaly sérové hladiny resistinu s MYOACT (r = 0,667, p = 0,001), kreatinkinázou (r = 0,739, p = 0,001) a hladinami myoglobinu (r = 0,791, p = 0,0003) a vykazovaly trend ke korelaci s CRP. Exprese resistinu ve svalové tkáni byla signifikantně vyšší u pacientů s IIM v porovnání s kontrolami. V mononukleárních buňkách indukovala stimulace resistinem expresi IL-1β a IL-6 a chemokinu MCP-1. Tento efekt jsme nepozorovali u myocytů.

4.5 Sérové hladiny interferonu α u pacientů s dermato-myozitidou/polymyozitidou nekorelují s aktivitou onemocnění

Sérové hladiny IFNα byly signifikantně nižší u pacientů s IIM než u zdravých i pozitivních kontrol (p = < 0,01); nepozorovali jsme závislost na denní dávce glukokortikoidů. Pacienti s pozitivitou anti-Jo-1 autoprotilátek měli hladiny signifikantně vyšší oproti negativním pacientům (n = 26, medián 117,8pg/ml oproti n = 19, medián 93,4pg/ml; p = 0,05). Neprokázali jsme rozdíl mezi pacienty s PM a DM. U pacientů s IIM sérové hladiny IFNα signifikantně negativně korelovaly s edémem svalů, vyjádřeném jako parametr intenzity signálu na MRI.

4.6 Autoprotilátkové specificity a aktivace dráhy interferonu typu I u idiopatických zánětlivých myopatií

IFN aktivita byla signifikantně vyšší u pacientů s myozitidou než u zdravých kontrol (p = 0,0007). Pacienti s pozitivitou autoprotilátek proti RNA-vázajícím proteinům měli vyšší IFN skóre než pacienti pro tyto protilátky negativní (p = 0,011); toto skóre bylo také asociované s autoprotilátkovou multispecificitou (p = 0,038). Vyšší IFN skóre jsme nalezli u pacientů s dermatomyozitidou a myozitidou s inkluzními tělísky v porovnání s polymyozitidou (p = 0,04 a p = 0,04). V porovnání s pacienty s nízkým IFN skóre vykazovala séra pacientů s vyšším IFN skórem signifikantně vyšší schopnost aktivace exprese IFN typ-I indukovatelných genů v dendritických buňkách; u těchto sér byla tato schopnost významně inhibovatelná přidáním jak protilátek proti IFN receptoru (p = 0,016), tak proti IFNα (p = 0,0095). IFN skóre pouze mírně korelovalo s aktivitou onemocnění hodnocenou lékařem, a to pouze u pacientů s dermatomyozitidou (r = 0,3778, p = 0,03). Nepozorovali jsme žádnou asociaci IFN signatury v séru s HLA-DRB1 genotypem.

4.7 Mikroaray-analýza cirkulující mikro RNA v sérech pacientů s polymyozitidou a dermato-myozitidou vykazuje odlišný expresní profil a je asociován s aktivitou onemocnění

Identifikovali jsme 23 signifikantně odlišně exprimovaných miRNA. 6 miRNA mělo odlišnou expresi ve srovnání se zdravými kontrolami. Oproti zdravým kontrolám jsme u dermatomyozitidy (DM) identifikovali 3 a u polymyozitidy (PM) pak 6 odlišně exprimovaných miRNA. U pacientů s vysokou aktivitou nemoci jsme pozorovali vyšší expresi 3 miRNA oproti pacientům s nízkou aktivitou. Dále jsme zaznamenali signifikantně rozdílnou expresi 26 miRNA u pacientů se SLE ve srovnání s pacienty s IIM, PM a DM.

5 Diskuse

Tato práce byla zaměřena na studium vztahu jednotlivých cirkulujících solubilních molekul imunitního systému, zejména autoprotilátek, prozánětlivých cytokinů a regulačních faktorů, k fenotypovým znakům idiopatických zánětlivých myopatií, expresi těchto molekul přímo ve svalové tkáni a na zhodnocení možného vlivu na buňky periferní krve i samotné svalové buňky a tím jejich významu v patogenezi IIM.

U autoprotilátek asociovaných s myozitidami nebo specifických pro myozitidy jsme prokázali silnou asociaci autoprotilátek anti-Jo-1 s kloubním postižením, respektive artritidou u pacientů s IIM; toto postižení má charakteristickou distribuci drobných ručních kloubů. Artritida nebo kloubní postižení je poměrně často vídaným příznakem IIM, nicméně souhrnná data na tuto problematiku jsou poměrně chudá (Citera, G. et al., 1994). Artritida je relativně častým příznakem u pacientů s autoprotilátkami proti tRNA syntetázám (Katzap, E. et al., 2011, Meyer, O. et al., 2009, Queiro-Silva, R. et al., 2001, Targoff, I.N., 1994). Naše výsledky též ukazují výrazně vyšší asociaci, než bylo v předchozích studiích naznačeno (Martinez-Cordero, E. et al., 2001, Nakajima, A. et al., 2012). Tato studie je dle našich poznatků první prací systematicky analyzující kloubní postižení u pacientů s IIM.

Také jsme potvrdili vztah autoprotilátek anti-HMGCR k imunitně zprostředkované nekrotizující myopatii (Mammen, A.L. et al., 2011) a výrazný vzestup incidence této formy IIM v posledních letech. Dle našich dat tento nárůst připadá na vrub statiny indukované IMNM. Většina našich pacientů se statinovou myopatií užívala atorvastatin, což ovšem může souviset s tím, že tento preparát je i nejčastěji předepisovaným statinem v ČR (SUKL1, SUKL2).

Identifikace odlišně exprimovaných sérových miRNA u pacientů s PM a DM. Odlišná exprese cirkulujících miRNA byla popsána u jiných autoimunitních onemocnění (Qu, Z. et al., 2014). Většina z námi identifikovaných miRNA byla již studována ve vztahu k různým onemocněním, včetně nádorových, kardiovaskulárních atd., nicméně zatím žádná z nich nebyla spojována s autoimunitními chorobami.

Z prozánětlivých cytokinů jsme se zaměřili na skupinu interferonu typu I. IFN typu I je v řadě studií popsán jako významný faktor patogeneze onemocnění: IFN typu I jsou silnými induktory exprese MHC molekul I a II třídy (Tournadre, A. et al., 2012), v periferních leukocytech i svalové tkáni myozitických pacientů byly nalezeny zvýšené exprese genů indukovatelných interferonem typu I (tzv. IFN I signature) (Walsh, R.J. et al., 2007). Obdobně byla prokázána i zvýšená exprese proteinů indukovaných IFN typu I: protein rezistence proti myxoviru A (MxA) v kožních (Wenzel, J. et al., 2005) a svalových (Greenberg, S.A. et al., 2005) biopsiích pacientů s DM, kde byl specificky zvýšen v místech aktivního zánětu a atrofizace svalových vláken (Salajegheh, M. et al., 2010). Překvapivým zjištěním je proto náš průkaz významné negativní korelace hladin IFNα a míry postižení svalů na magnetické rezonanci. Naproti tomu aktivita IFN-typu I, vyjádřená úrovní exprese IFN-typem-I indukovatelných genů korelovala s klinickou aktivitou onemocnění u pacientů s DM, avšak v kontrastu s tím jsme nepozorovali vztah klinické aktivity s hladinami IFNα s výjimkou trendu k asociaci s plicním postižením. Hladiny IFNα byly vyšší u anti-Jo-1 pozitivních pacientů a aktivita IFN-typu I byla též vyšší u pacientů s autoprotilátkovou multiplicitou, což je v souladu s tím, že imunokomplexy obsahující antisyntetázové protilátky (např. anti-Jo-1) mohou jako endogenní stimulační faktor indukovat produkci IFN-α v plazmocytoidních dendritických buňkách (Eloranta, M.L. et al., 2009).

Z dalších prozánětlivých cytokinů jsme prokázali asociaci klinické aktivity s hladinami resistinu, které byly u pacientů s DM i asociované s biochemickými ukazateli aktivity onemocnění. Jakkoli byl resistin původně asociován s metabolickými onemocněními, byly jeho zvýšené hladiny zaznamenány u revmatoidní artritidy (Bokarewa, M. et al., 2005, Migita, K. et al., 2006). Vzhledem k tomu, že jsme neprokázali vztah resistinu a svalové slabosti, je možné, že vyšší hladiny mohou odrážet spíš celkovou aktivitu nemoci včetně extra-muskulárního postižení než funkční postižení u IIM. Obdobně jako v případě resistinu je naše práce první, která popisuje pozitivní korelaci visfatinu s klinickou aktivitou u pacientů s anti-Jo-1 pozitivitou. V dřívějších studiích byl též prokázán jeho vztah s řadou onemocnění (kardiovaskulární, metabolická, zánětlivá, nádorová) (Nowell, M. et al., 2012) a jeho hladiny taktéž korelují s aktivitou a progresí revmatoidní artritidy a ankylozující spondylartritidy (Brentano, F. et al., 2007, Rho, Y.H. et al., 2009). Poněkud překvapivě se však neliší od zdravých kontrol u systémového lupusu a sklerodermie (Masui, Y. et al., 2013, Ozgen, M. et al., 2011, Vadacca, M. et al., 2009). Ve svalové tkáni pacientů s IIM jsme v porovnání se zdravými kontrolami detekovali zvýšené hladiny exprese resistinu a visfatinu.

Dle experimentálních výsledků naší studie mohou molekuly imunitního systému, cirkulující v sérech pacientů s IIM, hrát roli v patogenezi tohoto onemocnění. Prokázali jsme, že séra pacientů s IIM jsou schopna aktivovat dráhu interferonu typu I v buňkách periferní krve, za tuto aktivaci zodpovídá IFN-typu I, konkrétně především IFNα. V naší studii jsme též prokázali schopnost resistinu indukovat expresi dalších prozánětlivých cytokinů – interleukinů IL-1β a IL-6 a monocytárního chemoatraktivního proteinu MCP-1 v mononukleárních buňkách periferní krve; tento efekt jsme však neprokázali na myocytech.

6 Závěr

Uvedené výsledky prokazují vztah jednotlivých molekul imunitního systému k jednotlivým podtypům či fenotypovým projevům idiopatických zánětlivých myopatií a demonstrují význam těchto molekul v patogenezi tohoto onemocnění.

Heterogenita myozitid je více než v klinickém obraze vyjádřena v jejich patogenetických mechanismech a odráží se v imunofenotypové odpovědi u jednotlivých podtypů, což může být s výhodou použito v diagnostice a v budoucnu i v terapii těchto onemocnění.

adresa pro korespondenci:

MUDr. Martin Klein, Ph.D.

Revmatologický ústav

Na Slupi 4

128 50 Praha 2

e-mail: klein@revma.cz