Polymorfismus C677T genu pro methylentetrahydrofolát reduktázu je spojen se změnou léčebné odpovědi na methotrexát v populaci revmatoidní artritidy Východočeského regionu

Methotrexát (MTX) patří k základním lékům používaným při léčbě revmatoidní artritidy (RA). Efektivita léčby MTX u RA se pohybuje mezi 46 % až 65 % (hodnoceno podle kritéria ACR 20). Farmakogenetika se zabývá genetickou predispozicí pacienta pro odpověď na danou léčbu.

Cílem práce bylo zjistit, zda jednonukleotidový polymorfismus (SNP) C677T (rs1801133) pro MTHFR gen predikuje odpověď na perorální léčbu MTX u pacientů s RA z Východočeského regionu. Hodnocení účinnosti bylo provedeno na základě sledování změny DAS 28 (∆DAS 28) během prvních šesti měsíců léčby MTX. Do studie bylo zařazeno 120 pacientů, všichni splnili klasifikační kritéria pro RA (American College of Rheumatology – ACR 1987) a v minulosti nebo v současnosti byli léčeni perorálním MTX. Část nemocných byla léčena monoterapií MTX s glukokortikoidy nebo bez nich (n = 65), ostatní (n = 55) pacienti užívali MTX a zároveň konvenční syntetický DMARD nebo biologikum. Genotypizace byla provedena použítím qPCR alelické diskriminace. Při hodnocení za pomocí tzv. dominantního modelu CC versus (CT+TT) jsme nenalezli asociaci C677T SNP a EULAR odpovědi na léčbu MTX. Porovnáním genotypů (všech homozygotů a heterozygotů) za použití ∆DAS 28 během šesti měsíců MTX léčby jsme nalezli signifikatně zhoršenou odpověď na léčbu u genotypu 677CT (p = 0,01) u pacientů na MTX monoterapii. Tato asociance nebyla nalezena u skupiny kombinace MTX s jinými DMARDs (konvenčními syntetickými nebo biologickými) (p = 0,886).

Naše data svědčí pro možnou spojitost C677T SNP se zhoršenou odpovědí na léčbu MTX u RA.

Klíčová slova:
Revmatoidní artritida, methotrexát, methylentetrahydrofolát reduktáza, farmakogenetika, personalizovaná medicína

Úvod

Methotrexát (MTX) je základním lékem používaným při léčbě revmatoidní artritidy (RA) (1, 2). Jsou důkazy o účinnosti MTX na klinické symptomy nemoci pro časnou a pozdní RA se střední i vyšší aktivitou. Je znám vliv na zpomalení rentgenové progrese. MTX je součástí primární léčebné strategie u pacientů s aktivní RA a je vysoce efektivní v monoterapii, kombinaci s glukokortikoidy nebo jinými konvenčními syntetickými, chorobu modifikujícími léky (csDMARDs) a biologickými DMARDs (bDMARDs). Významný efekt je pozorován již po 4–6měsíční léčbě (4–8). Efektivita léčby RA MTX je mezi 46 % až 65 % (hodnoceno podle kritéria ACR 20). Při léčbě MTX se může vyskytnout celá řada nežádoucích účinků (NÚ). Alespoň jeden se objeví až u 72,9 % pacientů, závažné projevy toxicity se zjišťují až u 30 % pacientů.

Farmakogenetika je nový moderní směr klinické farmakoterapie umožňující personalizaci terapie na základě zjištění genetické predispozice pacienta pro odpověď na danou léčbu. Farmakogenetika se zabývá studiem geneticky podmíněné variability (většinou ve formě jednonukleotidových polymorfismů – single nucleotid polymorphisms (SNPs). Znalost genetických změn vedoucích k této variabilitě a možnost předpovědět reakci na léčbu může umožnit včasnou změnu dávkování nebo vysazení léčiva tak, aby pacient byl léčen efektivně a s co nejnižším rizikem vzniku NÚ.

Výzkum farmakogenetiky MTX u RA se soustředí na souvislost mezi terapeutickým účinkem či toxicitou MTX a mutacemi genů metabolických drah, transportérů MTX, genů podílejících se na účinku adenosinu, genů HLA-G antigenů a enzymů metabolismu bází nukleových kyselin. Nejlépe prostudovaným genem v intracelulárním metabolismu MTX je methylentetrahydrofolát reduktáza (MTHFR). Enzym MTHFR je klíčový pro konverzi 5, 10-metylentetrahydrofolátu na 5-metyltetrahydrofolát, který je nezbytný pro metylaci homocysteinu a vznik methioninu (9). Do současnosti bylo popsáno více než 10 polymorfismů pro gen MTHFR, detailněji však byly prostudovány pouze dva C677T a A1298C (10). SNP C677T způsobuje záměnu alaninu za valin na kodonu 222. Vzniká termolabilní varianta enzymu MTHFR s nižší enzymatickou aktivitou. Genotyp 677TT má prevalenci 8–10 %, aktivita enzymu je v tomto případě asi 30 %. V populaci je zhruba 40 % heterozygotů (677CT) s aktivitou enzymu kolem 60 %. U pacientů s alespoň jednou alelou T bylo prokázáno zvýšené riziko vzniku NÚ, především hepatotoxicity (11, 12). Podle většiny dostupných dat nebyl prokázán vliv na změnu efektivity léčby pro tento polymorfismus (9, 13).

Cílem práce je zjistit, zda polymorfismus C677T (rs1801133) pro MTHFR gen predikuje odpověď na léčbu MTX u pacientů s RA z Východočeského regionu. Hodnocení účinnosti bylo provedeno na základě sledování změny podle disesase activity score na 28 kloubech (∆DAS 28) během prvních šesti měsíců perorální léčby MTX u pacientů s RA. Byly zjišťovány vztahy mezi genotypem a klinickými prediktory aktivity RA: věk, pohlaví, kouření cigaret, seropozitivita revmatoidních faktorů (RF), pozitivita protilátek proti citrulinovanému peptidu (ACPA), přerušení léčby MTX a dávka MTX.

Soubor a metodika

Charakteristiky pacientů a uspořádání studie

Prezentujeme monocentrickou, regionální, retrospektivní a zčásti prospektivní, cross-sectional studii. Do studie bylo prvotně zařazeno a genotypováno 186 pacientů splňujících klasifikační kritéria Americké koleje revmatologů (ACR) 1987 (14), kteří aktuálně nebo dříve užívali perorální léčbu MTX v monoterapii nebo kombinaci s csDMARDs nebo bDMARDs. Zařazení pacienti byly léčeni MTX pro RA na 2. interní gastroenterologické klinice Fakultní nemocnice v Hradci Králové, podepsali informovaný souhlas se zařazením do studie a vyšetřením DNA. Všichni byli kavkazského původu a dospělého věku nad 18 let. Celkem 65 pacientů bylo léčeno monoterapií MTX (nebo kombinací s glukokortikoidy), 55 nemocných kombinací s csDMARDs či b DMARDs. Souběžná léčba byla zastoupena sulfasalazinem (n = 18), leflunomidem (n = 10), hydrochlorochinem (n = 18), cyklosporinem (n = 8), glukokortikoidy (n = 86). Průměrná dávka MTX ve skupině s MTX monoterapií byla 11,7 ± 2,9 mg, ve skupině kombinace MTX s csDMARDs a bDMARDs 11,0 ± 2,7 mg. Léčba kyselinou listovou byla prováděna u všech nemocných ve studii (dávka 40 mg den po MTX).

Efekt léčby byl hodnocen použitím DAS 28 na základě hodnocení EULAR odpovědi na začátku MTX léčby (15), prospektivně při vstupu do studie nebo retrospektivně ze zdravotnické dokumentace 2. interní gastroenterologické kliniky (u pacientů s MTX léčbou v anamnéze) a po šesti měsících léčby. Kalkulace DAS 28 byla provedena u 120 pacientů (u těchto pacientů byla dostupná potřebná data). Probandy jsme rozdělili na respondéry (pacienty s dobrou, střední odpovědí podle EULAR) a nonrespondéry. Jestliže nemocní po šesti měsících léčby dosáhli DAS 28 ≤ 3,2, pak pacienti s dobrou odpovědí na MTX léčbu byli definováni zlepšením DAS 28 > 1,2, střední odpověď jako zlepšení DAS 28 > 0,6 a ≤ 1.2, a nonrespondéři změnou ≤ 0,6. Pro pacienty s DAS 28 po šesti měsících > 3,2 a ≤ 5,1 byla střední odpověď definována jako zlepšení DAS 28 > 0,6, nonrespondéři se zlepšením DAS 28 ≤ 0,6. Nakonec v případě DAS 28 > 5,1 střední respondéři byli definováni zlepšením DAS 28 > 0,6, a nonrespondéři ≤ 0,6 (15). Účinnost MTX terapie v závislosti na SNP byla zjišťována v šestém měsíci léčby komparací distribucí genotypů s klinickou odpovědí (respondéři versus nonrespondéři). Zároveň byl efekt terapie hodnocen podle parametru ∆DAS 28.

Pro zjištění toxicity byly ze zdravotnické dokumentace zaznamenány NÚ. Všechny NÚ jsou popsány trváním, frekvencí, závažností a záznamem o pokračování v následné terapii. Léčba byla přerušena v případě mírných NÚ: mírné gastrointestinální symptomy, mírná mukozitida, perzistentní zvýšení AST/ALT do trojnásobku horního limitu laboratoře, perzistující leukopenie (3–3,5 x 109 buněk/litr), trombocytopenie (100–150 × 109 buněk/litr). Léčba MTX byla vysazena v případě závažných NÚ: závažné gastrointestinální symptomy, závažná mukozitida, podezření na MTX pneumonitidu, elevace AST/ALT ≥ trojnásobek horního limitu, leukopenie (<3,0 × 109 buněk/litr) nebo trombocytopenie (<100 × 109 buněk/litr).

Při vstupu do studie byla zaznamenána demografická data: věk, pohlaví, kouření cigaret, délka trvání RA a kloubní příznaky. Ze zdravotnické dokumentace byly v čase zahájení MTX zjištěny laboratorní parametry CRP, ACPA, RF, sedimentace erytrocytů (FW; mm/h), CRP (mg/l), krevní obraz, sérová hladina bilirubinu, plazmatická aktivita ALT, AST, ALP, clearance kreatininu (počítaná pomocí Cockcroft-Gault vzorce). Všechna klinická data byla uvedena také po šesti měsících léčby. Potenciální klinické prediktory aktivity RA byly vybrány na základě literatury. Klinické prediktory zahrnují věk, pohlaví, kouření cigaret (kuřák x nekuřák), RF status, ACPA status (16, 17).

Terapie MTX byla přerušena u 13 pacientů pro NÚ během šesti měsíců léčby, tito pacienti byli ze studie vyřazeni.

Klinická data byla dostupná u 120 RA pacientů, kteří jsou charakterizováni: průměrným věkem 58,5 roků, SD ± 12,6, věkovým rozmezím 29–85 roků, a počtem mužů n = 32 (26,7 %). Skupiny rozdělené podle genotypu byly porovnatelné v závislosti na DMARDs farmakoterapii, vstupní hodnotě DAS 28, přerušení MTX léčby a MTX dávky na začátku léčby. Charakteristiky skupin pacientů jsou uvedeny v tabulce 1.

Studie byla schválena Etickou komisí Fakultní nemocnice Hradec Králové, Česká republika, a byla prováděna v souladu s principy Helsinské deklarace z roku 1975, revize z roku 1983.

Genotypizace

Všech 186 pacientů s RA a 80 probandů kontrolní skupiny (vzorku tzv. běžné populace) bylo genotypováno za použití genotypizačního testu: genomická DNA byla extrahována z krve za použití QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen). Samotná genotypizace byla provedena qPCR alelickou diskriminací za použití komerčního setu TaqMan (allele-specific) assays (LifeTechnologies). Míra úspěšnosti byla vždy vyšší než 95 %. Genotypy sledovaného C677T SNP ve skupině s RA a v kontrolní skupině nevykazují deviaci v Hardy-Weinbergově rovnováze. 

Statistika

Logistická regresní analýza byla použita pro výpočet v případě dichotomického rozdělení na respondéry (dobrá a střední odpověď) a nonrespondéry za použití EULAR kritérií. Výsledky byly vyjádřeny pomocí odds ratio (OR) s 95% konfidenčním intervalem (95% CI).

Rozdíly mezi respondéry a nonrespondéry byly vyjádřeny za použití Mann-Whitney U testu nebo chí-kvadrát testu. Vliv genetických variant na ∆ DAS 28 byl zjištěn pomocí jednocestné ANOVA analýzy při porovnání wild-type homozygotů, heterozygotů, a variantních homozygotů.

V analýze bylo použito technologie GML/FENENAL, BOOSTRAP typ. Statistické rozdíly klinických a laboratorních parametrů mezi haplotypy byly analyzovány t-testem nebo ANOVA testem. Byla zvolena statistická hladina významnosti p < 0,05. Všechny statistické analýzy byly provedeny SPSS verzí 16 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Výsledky

Nebyly nalezeny statisticky významné rozdíly v distribuci genotypů mezi RA probandy a kontrolní skupinou (p = 0,722). Zároveň u variantních homozygotů pro 677TT nebylo zjištěno zvýšené riziko pro RA (OR = 1,370 95% CI = 0,343 – 5,474, p = 0,656). Rozdělení kohorty podle genotypizace bylo následující: 6 (9,2 %) 677TT homozygotů a 32 (49,2 %) 677CT heterozygotů.

Efekt MTX léčebné odpovědi podle EULAR

Při hodnocení efektu léčby podle kritérií EULAR odpovědi bylo 80 pacientů ze 120 (66,6 %) klasifikováno jako respondéři. Nebyl nalezen vztah C677T SNP s efektem nízkodávkové perorální léčby MTX u RA kohorty Východočeského regionu za použití stratifikace podle tzv. dominatního modelu CC versus (CT+TT) (tab. 2, 3).

Efekt MTX léčby podle ∆DAS 28

Poté byla analyzována účinnost léčby pomocí kvantnitativního parametru ∆DAS 28. Podle výsledků byl genotyp 677CT statisticky významně asociován s nižší odpovědí na MTX léčbu u pacientů na MTX monoterapii během šestiměsíční léčby. Tato asociance nebyla nalezena u skupiny kombinace MTX s jinými DMARDs (konvenčními syntetickými nebo biologickými) (p = 0,886). V porovnání s pacienty na monoterapii MTX je statistická významnost p = 0,025, η² = 0,112 – medium effect size.

Efekt MTX léčby ve skupině monoterapie MTX

Pacienti na monoterapii MTX měli po šesti měsících léčby výrazně nižší absolutní hodnoty DAS 28 oproti skupině na kombinované terapii MTX + csDMARDs a bDMARDs (tabulka 1). Post-hoc testy ukázaly signifikantně sníženou odpověď na léčbu v případě 677CT genotypu oproti wild-type homozygotům CC a mutantním homozygotům TT. Rozdíl průměrné ∆DAS 28 u CT vs. CC genotypů (vyjádřeném ∆ DAS 28 po šesti měsících léčby) byl 0,885, CI 95% = (0,105, 1,667); p = 0,027. V případě CT vs. TT, byl rozdíl ∆ DAS 28 1,448 CI 95% = (0,119, 2,776); p = 0,033. Nebyl zjištěn signifikantní rozdíl mezi CC a TT homozygoty p = 0,407 (viz graf 1). Různé genotypy C677T SNP se nelišily porovnáním klinických prediktorů aktivity RA: věk, pohlaví, kouření cigaret (kuřák x nekuřák), RF status. Pacienti na monoterapii MTX s genotypem 677CC měli významně vyšší frekvenci pozitivity ACPA autoprotilátek oproti genotypu 677CT a TT (tab 1).

Diskuse

Předchozí výzkum neodhalil odlišnou distribuci C a T alel polymorfismu 677 v běžné populaci oproti nemocným s RA (18). To je také v souladu s našimi výsledky. Zkoumali jsme nejprve rozdíly v léčebné odpovědi mezi skupinami rozdělenými podle genotypu CC versus (CT+TT). To odpovídá tzv. dominantnímu modelu, za předpokladu dominantního efektu minoritní alely je to konzistentní s hodnocením v předchozích studiích a meta-analýzách. Naše hodnocení OR pro respondéry a nonrespondéry nevedlo k významným rozdílům v odpovědi na léčbu podle EULAR. Užití tohoto modelu ve studiích ukázalo nejednoznačné/konfliktní výsledky. Více studií neprokázalo asociaci polymorfismu s NÚ (11, 19, 20), některé studie ukázaly vyšší výskyt gastrointestinální toxicity (11, 21). Část studií svědčila pro lepší účinnost MTX u 677CC homozygotů: hodnocené DAS 44 < 2,4 podle Wessels a kol. (16), hodnocené ACR 20 podle Kurzawski a kol. (22). Na druhou stranu zbytek studií nenalezl vztah polymorfismu k efektu léčby MTX (20, 23, 24). Fisher a Cronstein publikovali v roce 2009 rozsáhlou meta-analýzu. Význam této práce spočívá ve velikosti vzorku nemocných RA s více než 1400 pacienty. Meta-analýza neukázala dostatečná data pro potvrzení asociace C677T SNP s toxicitou nebo účinností MTX (25). Také závěry recentní meta-analýzy s celkem 1140 RA pacientů podle Owena a kol. nesvědčí pro predikci odpovědi na léčbu MTX u C677T SNP (13). Menší počet studií hodnotil odpověď na léčbu podle rozdělení na jednotlivé genotypy (16, 22, 26–28). Naše práce hodnotí vliv genotypu (při porovnání wild-type, variantních homozygotů a heterozygotů) na MTX účinnost stanovenou ∆DAS 28. Porovnává také skupiny MTX monoterapie a kombinované MTX léčby s jinými DMARDs. 677CT heterozygoti měli signifikantně nižší odpověď na základě ∆DAS 28 oproti oběma homozygotům. Podle literatury vede mutace C677T ke snížené aktivitě enzymu MTHFR, která je zároveň pozorována i u heterozygotů (29). Předchozí data ukázala klinický význam 677CT heterozygozity v mnoha klinických příkladech (výskytu gliomu, demence, aterosklerózy) (30–33). Vzhledem k nízkému počtu 677TT homozygotů ve studii nebyl pravděpodobně naplněn možný předpoklad nízké odpovědi 677TT homozygotů na léčbu.

V literatuře jsou zmiňovány limitace v hodnocení různých studií nebo meta-analýz. Byl komentován design studií a nastavení hodnotících parametrů (prospektivní/retrospektivní, ambulantní/hospitalizovaní pacienti), variabilita prostředí, definice MTX toxicity a efektu. Jsou diskutovány enviromentální proměnné, jako saturace populace kyselinou listovou lokálními dietními zvyklostmi, rozdíly v kouření cigaret mezi populacemi. Také suplementace kyseliny listové goegraficky kolísá (u nekavkazské populace jsou obvykle používány nižší dávky MTX a kyseliny listové při její suplementaci) (13). Nízký příjem kyseliny listové může mít větší klinické důsledky u pacientů s genotypem 677TT spojené se zvýšenou hladinou homocysteinu oproti genotypu 677CC nebo CT.

Na výsledky studií má rovněž vliv komedikace jinými DMARDs v porovnání s nemocnými na monoterapii MTX. Na základě tohoto faktu porovnáváme obě skupiny. Význam genotypizace C677T SNP se ukázal pouze v případě skupiny s monoterapií. Důležitým aspektem MTX léčebné účinnosti je také dávka léku. Pacienti v této studii nebyli léčeni v současnosti běžně doporučovanými dávkami perorálního MTX. Nyní je za efektivnější považována dávka mezi 20–30 mg na týden. Vysoká dávka MTX by měla být dosažena během osmi týdnů po zahájení léčby, jako důležitý aspekt léčebného úspěchu (2, 34, 35). V této studii byla průměrná dávka (11,0 mg/týden) ovlivněna doporučeními a zvyklostmi léčby RA v době zahájení MTX léčby. Dávka je porovnatelná s dávkami ve studiích podrobených meta-analýze Owenem a kol. (13). Retrospektivní část naší studie zařadila nemocné s počátkem léčby MTX v roce 2002. Přitom v roce 2003 byla průměrná dávka MTX u pacientů léčených pro RA 10 mg za týden (35, 36). Definice léčebné odpovědi mezi studiemi není plně standardizována. Byly vyvinuty dva hlavní způsoby měření aktivity. Není známo, který způsob je přínosnější. EULAR kritéria pro odpověď na léčbu jsou založeny na ∆DAS 28. ACR kritéria jsou založena na procentuální změně hlavních proměnných. Obě metody jsou validizovány pro klinická hodnocení (15). Je zřejmé, že komedikace (glukokortikoidy, konvenčními syntetickými nebo biologickými DMARDs, nesteroidními antirevmatiky a analgetiky) a komorbidity mění léčebnou odpověď MTX.

Geografická variabilita je ukázána na rozdílech v prevalenci RA. Navíc C677T SNP má svojí geografickou heterogenitu. Okolo 10 % severoamerické populace jsou 677TT homozygoti. Je známa etnická variabilita, výskyt T alely je vyšší mezi středomořím (hispánci) než u kavkazské populace, ale ta je zároveň vyšší než afrických Američanů (18). Lokality extrémní frekvence distribuce vykazují deviaci Hardy-Weinbergovy rovnováhy (Helsinky, jižní Itálie a jižní Čína). Tyto nálezy svědčí pro přítomnost selektivního tlaku vedoucího k vyhraněné variaci (37). V porovnání s předchozími daty je frekvence 677TT genotypu v naší studii relativně nižší.

Limitace práce

Je nezbytné zmínit, že práce má své limitace. Jde o monocentrickou, z velké části retrospektivní. Nízkodávková MTX léčba vedla k nízkému výskytu na MTX závislých NÚ a relativně nízkému počtu nemocných vyřazených pro NÚ.

Tato práce je součástí projektu hodnotícího více SNP s možným vlivem na léčbu MTX u RA: SNP A1298C pro MTHFR gen, SNP pro gen přenašeče SLC19A1, SNP genu pro efluxní transportéry ABC, polymorfismus pro gen metylentetrahydrofolát dehydrogenázy MTHFD1 gen, polymorfismus pro gen dihydrofolátreduktázy DHFR 829C>T, SNP pro geny funkce adenosinu (AMPD1, ATIC, ITPA). Další výsledky budou publikovány později.

Závěry

Nebyl prokázán vliv SNP C677T hodnocený podle dominantního modelu CC versus (CT+TT) na léčebný výsledek stanovený podle EULAR odpovědi. Nebyl shledán význam genopytizace pro C677T SNP u pacientů léčených kombinací MTX s cs nebo bDMARDs. Statisticky významné rozdíly byly zjištěny při porovnání skupin různých genotypů hodnocením odpovědi na léčbu podle ∆DAS 28. Heterozygoti 677CT na monoterapii MTX měli v porovnání s homozygoty významný vliv na sníženou odpověď při MTX léčbě podle ∆DAS 28. Není jasné, proč nebyla nalezena odlišná odpověď na léčbu u 677TT homozygotů oproti homozygotům 677CC a heterozygotům 677CT.

Závěrem lze říci, že výsledky práce ukazují na prediktivní hodnotu C677T SNP pro efekt nízkodávkové perorální léčby MTX u populace RA Východočeského regionu. S přihlédnutím k výsledkům práce je třeba dalších studií k průkazu těchto souvislostí.

Podpořeno MZ ČR – RVO (FNHK, 00179906)

Poděkování patří našim pacientům a nelékařským zdravotním pracovníkům účastnícím se na této práci.

Adresa pro korespondenci:

MUDr. Tomáš Soukup, Ph.D.

2. interní gastroenterologická klinika

Fakultní nemocnice Hradec Králové

Sokolská 581

500 05 Hradec Králové

e-mail: soukutom@fnhk.cz