miRNA profil luminálnych podtypov karcinómu prsníka v súbore slovenských žien

Overview

Cieľ štúdie: Aberantná expresia krátkych, nekódujúcich molekúl RNA (miRNA) sa podieľa na vzniku, progresii a metastázovaní karcinómu prsníka. Úroveň expresie vybraných miRNA je úzko spojená nielen s imunohistochemickým profilom a histopatologickými parametrami, ale aj s klinickými výsledkami, prognózou a terapeutickou odpoveďou. Cieľom tohto výskumu bola analýza celého spektra miRNA metódou microarray a zadefinovanie panelu relevantných miRNA objasňujúcich biologickú charakteristiku luminálnych podtypov karcinómu prsníka.

Typ štúdie: Prierezová, základný výskum.

Názov a sídlo pracoviska: Martinské centrum pre biomedicínu, Jesseniova lekárska fakulta v Martine, Univerzita Komenského v Bratislave, Martin, Slovenská republika.

Metodika: Sledovaný súbor pozostával zo 16 tkanív Luminal A/Luminal B karcinómu prsníka a  16 tkanív prsného tkaniva bez patologického nálezu. miRNA profil sa analyzoval microarray technológiou na sklíčku SurePrint G3 Human miRNA kit v.21, ktoré obsahuje 2549 miRNA. Výsledky sa hodnotili knižnicou AgiMicroRNA Bioconductor library v rámci balíka Limma.

Výsledky: Analýza najnižšej hodnoty FDR p-value a najvyššej hodnoty logFC označila za najdôležitejšiu onkogénnu miRNA s vyššou expresiou v súbore nádorových tkanív v  porovnaní s  normálnymi tkanivami miR-182, nasledovala miR-21, miR-342-3p a miR-342-5p a miR6826. Medzi miRNA s  nižšou expresiou dominovala miR-4324 a kluster miR-99a/let7c/miR-125b.

Záver: Získané výsledky prispievajú k biologickej charakterizácií skupiny luminálnych typov karcinómu prsníka, ponúkajú východisko pre nadväzujúce projekty v  kontexte objasnenia príslušných signálnych dráh mechanizmov karcinogenézy a  sľubujú nové a inovatívne možnosti cielenej terapie zameranej na špecifické miRNA zapojené v dôležitých mechanizmoch karcinogenézy.

Klíčová slova:

miRNA – karcinóm prsníka – microarray

ÚVOD

Karcinóm prsníka (KP) je najčastejším zhubným nádorom u  žien s  celosvetovou incidenciou 2 088 849 nových prípadov v  roku 2018 [5]. Najčastejšie vzniká v dvoch typoch prsného tkaniva, v duktoch alebo lobuloch. Podľa estrogénového a progesterónového hormonálneho statusu a podľa HER2 stavu receptorov sa delí karcinóm prsníka do podtypov: luminálny A, luminálny B, HER2 pozitívny a triple negatívny nádor [29]. Jednotlivé nádory majú nielen odlišné biologické vlastnosti, ale aj histológiu, klinické prejavy, prognózu, odpoveď na liečbu a  prežívanie pacientok [27]. Luminálne typy predstavujú najčastejší typ KP (70 %) s pomalým rastom, dobrou prognózou a  nižším rizikom mortality v porovnaní s ostatnými typmi. Nakoľko exprimujú estrogénový receptor, adjuvantná endokrinná terapia je vysoko senzitívna. Avšak aj napriek tomu u 40 % pacientov dochádza k relapsu ochorenia [1, 4].

Na správnu identifikáciu, klasifikáciu nádoru a vytvorenie efektívnej terapie na princípe personalizovanej liečby „ušitej na mieru“ podľa špecifického podtypu nádoru, vstupujú v  poslednom období do algoritmov aj tzv. omic dáta predstavujúce napríklad génovú signatúru, globálnu génovú expresiu a  epigenetické markery [11, 21, 24, 29]. Veľký význam v biologickej charakterizácií a správaní sa nádoru majú aj krátke, nekódujúce molekuly miRNA, ktoré kontrolujú génovu expresiu na posttranskripčnej úrovni. Mechanizmus regulácie spočíva v  naviazaní miRISC komplexu (miRNA induced silencing complex) na komplementárnu sekvenciu v  3´UTR oblasti cieľovej mRNA, čím dochádza k jej vyblokovaniu, spôsobujúcej inhibíciu translácie, alebo mRNA degradáciu [2, 9, 15]. Väzba miRNA-mRNA je komplexná, nakoľko jedna miRNA sa môže viazať na stovky cieľových génov a  zároveň jedna cieľová mRNA môže byť regulovaná viacerými miRNA. miRNA tak v bunkách zabezpečujú rozmanité fyziologické funkcie, ako bunkovú diferenciáciu, proliferáciu, bunkovú smrť a zachovanie biologickej homeostázy [19, 23]. V procese karcinogenézy zohrávajú miRNA tumor supresorovú ako aj onkogénnu funkciu spojenú s iniciáciou nádoru, rezistenciou na liečbu a s metastatickými procesmi [14, 23].

Cieľom nášho výskumu bolo stanoviť komplexný miRNA profil luminálnych typov karcinómu prsníka metódou microarray v súbore slovenských žien a doplniť tak biologické charakteristiky tohto častého ochorenia.

SÚBOR

Zo 66 odobraných tkanív (28 karcinómov prsníka, 28 tkanív priľahlého tkaniva, 10 vzoriek prsného tkaniva bpn) sme do tejto analýzy vyselektovali 16 tkanív luminálneho typu KP a  16 vzoriek bez patologických nálezov. Vzorky pochádzali od žien, ktoré boli hospitalizované a  liečené na Gynekologicko-pôrodníckej klinike Univerzitnej nemocnice Martin. Ženy boli informované a podpísali informovaný súhlas pacienta. Histopatologická špecifikácia nádorov ako histologický typ a molekulárny podtyp boli poskytnuté z Ústavu patologickej anatómie UNM. Projekt bol schválený etickou komisiou č. 1866/2016.

METODIKA

Izolácia

Celková RNA so subfrakciou miRNA bola izolovaná z čerstvého tkaniva uchovávaného v RNA later stabilizačnom roztoku pri -80°C kitom mirVana™ miRNA Isolation Kit (Thermo Fisher Scientific). Kvalitatívna a kvantitatívna analýza prebehla na prístroji Qubit 2.0 a Bioanalyser 2100. Na miRNA analýzu sa použili iba vzorky s koncentráciou RNA > 50 ng/µl a RIN > 7.5.

Microarray miRNA analýza

Na analýzu expresie miRNA sme použili sklíčko SurePrint G3 Human miRNA kit v.21, na ktorom sa nachádza 2549 miRNA podľa miRBase 21.0 [12]. Príprava vzoriek na microarray analýzu prebiehala podľa protokolu Agilent verzia 3.1.1 s  použitím Spike-in transkriptov v  nasledovných krokoch: defosforylácia (CIP), ligácia (Cyanine 3-pCp), purifikácia (Micro Bio-Spin P-6 Gel Coumn), hybridizácia (20 hod, 55 °C), premývanie, skenovanie (SureScan Microarray Scanner, Agilent) a extrakcia dát (Feature Extraction Software). Kontrola kvality microarray miRNA expresie každej vzorky bola posúdená na základe QC správy. Na ďalšiu analýzu postúpili iba vzorky vykazujúce výbornú a dobrú kvalitu vo všetkých ôsmych sledovaných parametroch.

Štatistická analýza

Získané dáta boli analyzované knižnicou AgiMicroRNA Bioconductor library v rámci balíka Limma. V  tejto fáze prebehla posledná kontrola kvality vzoriek na základe MA plot-ov. Rozdielna expresia miRNA bola vyhodnotená finálne medzi 16 vzorkami karcinómu prsníka luminálneho typu a 16 kontrolnými vzorkami. Na selekciu najvýznamnejších 20 miRNA sme použili Volcano plot, ktorý zohľadňuje korigované FDR p-hodnoty, ako aj výšku log2 fold change.

VÝSLEDKY

Zo všetkých 2549 miRNA sme zachytili hybridizačný signál pri 307 miRNA, z toho 171 malo vyššiu expresiu a 136 nižšiu expresiu v súbore KP v porovnaní s kontrolnou skupinou. Panel 20 najviac relevantných miRNA, podľa Volcano plot analýzy, je uvedený v Tabuľke 1 aj s hodnotami log2 násobku expresie (log2FC) a FDR p-hodnotami.

Normalizované hodnoty log2 expresie podľa Z-skóre sme využili na zostrojenie heatmapy zobrazujúcej nielen expresiu miRNA v  jednotlivých vzorkách, ale aj hierarchické zoskupovanie vzoriek a miRNA (obr. 1).

V prípade výberu miRNA iba podľa najväčšieho rozdielu expresie (log2FC) by bolo poradie prvých 10 miRNA s vyššou expresiou v súbore s KP: miR-182- 5p, miR-183-5p, miR-4455, miR-141-3p, miR-4428, miR-6785-5p, miR-21-3p, miR-1973, miR-96-5p, miR-4485-3p a poradie 10 miRNA s nižšou expresiou: miR-4324, miR-451a, miR-99a-5p, miR-205- 5p, 125b-5p, miR-144-3p, miR-100-5p, miR-145-5p, miR-335-5p a miR-199b-5p. (obr. 2).

V prípade výberu najvýznamnejších miRNA iba podľa FDR p-hodnôt je poradie 10 miRNA s vyššou expresiou: miR-6826-5p, miR-342-3p, miR-21-3p, miR-182-5p, miR-342-5p, miR-4485-3p, miR-4443, miR-210-3p, miR-181b-5p, miR-96-5p a 10 miRNA s nižšou expresiou v súbore s KP: miR-4324, miR99a-5p, miR-125b-5p, miR-100-5p, miR-145-5p, miR-10b-5p, miR-195-5p, miR-130a-3p, miR-335-5p a miR-497-5p.

DISKUSIA

Aberantná expresia miRNA v kontexte nádorových ochorení bola prvýkrát opísaná v roku 2002 u pacientov s B-chronickou lymfocytovou leukémiou [3], u pacientov s karcinómom prsníka v roku 2005 [7]. Odvtedy sa zrealizovalo veľké množstvo štúdií, ktoré potvrdili dereguláciu miRNA ako charakteristický znak rakoviny v  dôsledku mutácií, delécií, amplifikácií a dysregulácie transkripčných regulačných kaskád [13]. Postupom času pribúdali nielen novo objavené molekuly miRNA, ale sa aj klasifikovali podľa funkcie a úlohy v celom klinickom manažmente rakoviny. miRNA sú zapojené do iniciácie, proliferácie, progresie, rezistencie na apoptózu, metastatického procesu, invazivity, ako aj odpovede na liečbu [10, 13].

Cieľom nášho výskumu bolo stanoviť expresný profil luminálnych typov karcinómu prsníka v súbore slovenských žien. Silnou stránkou tejto analýzy bola použitá microarray technológia, ktorá umožnila analýzu všetkých známych miRNA, v tomto prípade 2549, podľa poslednej dostupnej databázy miRBase 21.0. Na základe recentnej literatúry sme spomedzi definovaných onkogénnych miRNA očakávali vyššiu expresiu predovšetkým miR-10b, miR-21, miR-155, miR-210 a miR-373 [6, 8, 18]. Avšak analýza najnižšej hodnoty FDR p-value a najvyššej hodnoty log2FC označila za najdôležitejšiu onkogénnu miR-182, nasledovala miR21, miR-342 a miR-6826. Relevantnosť miR-182 sa potvrdila aj selekciou iba podľa log2FC, alebo FDR p-value.

Gén pre miR-182 sa nachádza na 7. chromozóme a miR-182 tvorí klaster spolu s miR-183 a miR-96 [12]. Onkogénny charakter tejto miRNA spočíva v  podpore proliferácie a  invazivity nádorových buniek a vysoká expresia miRNA sa spája s horším prežívaním. Deplécia miR-182-5p, ako sa ukázalo na myšacom xenoimplantátovom modeli, potláča rast nádoru prostredníctvom zvýšenej regulácie expresie PTEN [30]. Výskum inhibície miR-182 na bunkových líniách KP MCF-7 poukazuje na zníženú viabilitu buniek v dôsledku indukcie apoptózy, pravdepodobne cez zvýšenú expresiu CASP9, pričom túto asociáciu potvrdila aj western blot analýza [17]. Práca autorov Amorim et al. [1] označuje miR-182 za nezávislý prediktor endokrinnej terapie, ale aj za nezávislý marker prognózy rekurencie ochorenia po endokrinnej terapii a to práve v prípade pacientov s luminálnymi typmi KP. Prvé štúdie zamerané na prepojenie miRNA s reakciou na liečivá zistili okrem iného aj asociáciu miR-182 s rezistenciou na Veliparib [26]. Poznatky týchto prác poskytujú nové informácie vplyvu miRNA na jednotlivé metabolické dráhy, objasňujú funkcie a biologické úlohy a predstavujú potenciálne nové terapeutické ciele liečby karcinómu prsníka.

Tumor supresorové miRNA majú v nádorových bunkách obvykle nižšiu expresiu vzhľadom na ich charakter potláčania onkogénnej aktivity cieľových génov. Medzi hlavné miRNA z tejto skupiny patrí let-7, miR-31, miR-99a, miR-125a/b, miR-200, miR-205, miR-206, miR-335 [6, 8, 18, 28]. V našom projekte boli najdôležitejšie miRNA s nižšou expresiou v nádorovom tkanive v porovnaní s normálnym tkanivom: miR-4324, miR-99a a miR-125b a to vo všetkých troch prístupoch selekcie. Aspoň v dvoch metódach dominovala ešte miR-100 a miR- -451a. Sú to pomerne známe miRNA molekuly, predovšetkým kluster miR-99a/let7c/miR-125b [16, 20, 25]. Interpretácia expresie miR-4324 však zostáva menej jasná, nakoľko sa jej venovalo iba málo vedeckých prác.

Rozmanitosť miRNA panelov špecifických pre karcinóm prsníka v odbornej literatúre je odôvodniteľná predovšetkým: 1. – typom použitej metódy a jej citlivosti (niektoré umožňujú sledovať miRNA iba jednotlivo, čím sa pri selekcii nemusia zachytiť viaceré relevantné miRNA, iné metódy sledujú už hotové panely miRNA; nami zvolená metóda microarray analyzuje všetky existujúce miRNA); 2. – obdobím výskumu: počet známych miRNA neustále rastie, a teda výskumy z roku 2020 nemusia prinášať koherentné výsledky s predchádzajúcimi štúdiami; 3. – štruktúrou výskumu: niektoré práce porovnávajú podtypy KP medzi sebou, prípadne KP podľa histopatologických charakteristík (veľkosť, TNM, grade), iné práce porovnávajú KP so zdravým tkanivom / resp. priľahlým tkanivom, čo v konečnom dôsledku identifikuje rôzne špecifické miRNA podľa kategorizácie, či priebehu ochorenia.

Komplexnosť miRNA problematiky dopĺňa aj samotný fenomén väzby akejkoľvek miRNA na niekoľko desiatok cieľových mRNA s vplyvom na rozmanité biologické procesy súčasne [22]. Niektoré miRNA tak podľa typu nádoru zohrávajú onkogénnu, alebo aj tumor supresorovú funkciu, a to predovšetkým ovplyvňovaním tumor supresorových génov alebo onkogénov [10]. Okrem priameho vplyvu môžu miRNA modulovať aj vonkajšie faktory meniace nádor, ako napríklad interakciu s imunitným systémom, interakciu stromálnych buniek, onkovírusy a odpoveď na liečbu. Až výsledná rovnováha medzi týmito procesmi určuje, či má špecificka miRNA onkogénny alebo tumor supresorový účinok.

Komplexné pochopenie celej problematiky väzby miRNA-mRNA a  jednotlivých signálnych dráh by mohlo umožniť skorú detekciu, presnú diagnostiku, spoľahlivú prognózu, ako aj identifikáciu špecifických cieľov liečby s dôrazom rozvoja personalizovanej terapeutickej stratégie [10, 22].

ZÁVĚR

Analýza 2549 molekúl miRNA potvrdila 171 miRNA s vyššou expresiou a 136 miRNA s nižšou expresiou v súbore tkanív luminálnych typov karcinómu prsníka v porovnaní z tkanivami bez histopatologického nálezu. Top 20 miRNA s najväčším rozdielom a teda predpokladaným vplyvom na jednotlivé procesy karcinogenézy s onkogénnym potenciálom sú: miR-182-5p, miR-21-3p, miR-342-5p, miR-342-3p, miR-6826-5p a s tumor supresorovým charakterom: miR-4324, miR-451a, miR-99a-5p, miR-125b-5p, miR-100-5p, miR-145-5p, miR-335-5p, miR-199b-5p, miR-143-3p, miR-10b-5p, miR-195-5p, miR-497-5p, miR-130a-3p, miR-140-3p, miR-126-3p.

Tieto prvotné výsledky prinášajú doplňujúce informácie biologickej charakteristiky vybraných nádorov prsnej žľazy a otvárajú potenciál ďalších analýz zameraných na podrobnejšiu charakterizáciu jednotlivých podtypov KP a  interpretáciu klinickej a predikčnej relevantnosti.

Táto práca bola podporená projektami APVV-16-0021 a VEGA 1/0199/17.

doc. RNDr. Zuzana Dankova, PhD.

Martinské centrum pre biomedicínu

Jesseniova lekárska fakulta

Univerzita Komenského

Malá hora 4C

036 01 Martin

Slovenská republika

e-mail: zuzana.dankova@uniba.sk