Screeningové vyšetření endometriálních NK buněk u vybraných infertilních pacientek
1. část – metodika a průběžné výsledky

Úvod:
Přirození zabíječi (natural killer cells – NK bb) patří mezi jedny z nejdůležitějších buněk našeho imunitního obranného systému. Jsou přítomny v krvi, v decidue, ale i v sekrečním endometriu. Mají velký význam při implantaci, ale mohou svou zvýšenou buněčnou imunitou i negativně ovlivnit probíhající graviditu.

Cíl studie:
Sledujeme vztah hustoty NK bb CD56+ a CD16+ v krvi a v sekrečním endometriu u pacientek s doposud nevysvětleným opakovaným potrácením. Současně se zaměřujeme na diagnózu antifosfolipidového syndromu, vrozených trombofilních faktorů, stres a délku hormonální antikoncepce před početím.

Typ práce:
Původní práce – prospektivní studie.

Název a sídlo pracoviště:
Genetika-Plzeň, s.r.o.

Metodika:
Vyšetřovali jsme 59 žen ve věku 25–41 let (průměr 34), které měly v anamnéze tři až devět potratů. Sledovali jsme jejich krevní buňky průtokovou cytometrií a endometrium z hysteroskopie provedené 22.–24. den menstruačního cyklu. Soustředili jsme se především na analýzu buněčné imunity zaměřené na identifikaci lymfocytů se znaky CD56+ a CD16+. Antifosfolipidové protilátky jsme vyšetřovali pomocí ELISA metody.

Výsledky:
Studie pokračuje, prezentujeme průběžné výsledky.

Vysokou hustotu endometriálních NK bb CD56+ jsme nalezli u 41/57, NK bb CD16+ u 40/57, oboje, CD56+ a CD16+, pak u 36/57 pacientek. U 13 žen jsme tyto buňky v sekrečním endometriu nalezli jen sporadicky. NK bb CD56+ a CD16+ v krvi měly všechny pacientky zcela v normálních hodnotách. Tři z nich mají pozitivní leidenskou mutaci v homozygotní formě, 18/57 pak prokázaný antifosfolipidový syndrom, 12 je vysokoškolaček, čtyři z nich, lékařky, slouží pravidelně noční služby v nemocnici.

Závěr:
Nadprodukce NK buněk je spojena se zvýšenou aktivitou embryocytotoxických cytokinů, které mohou negativně ovlivnit těhotenství. Léčba pacientek i s patologickými imunologickými nálezy musí být řešena individuálně, což brzy ukážeme ve druhé části naší studie.

Klíčová slova:
neplodnost, natural killer cells, endometrium

ÚVOD

Není-li synchronizován neuro-endokrinně imunitní systém především v době implantace, pak proces otěhotnění různě selhává. Zanořování embrya do sekrečního endometria vyžaduje komplexní proces, při kterém vysoká denzita lokálních „přirozených zabíječů“ – natural killer cells (NK bb) může ovlivnit nejen iniciální, ale i pozdější průběh gravidity. Jako diagnostický test se v současné době používají především údaje o hladinách NK bb v krvi.

NK bb obecně patří mezi jedny z nejzákladnějších heterogenních představitelů buněčné imunity vůbec. Jsou charakterizované přirozenou cytotoxicitou, podílejí se tedy na antiinfekční imunitě, ničí viry a bakterie hlavně tím, že produkují cytotoxické cytokiny nebo jsou těmito cytokiny právě aktivovány. Podílejí se také na destrukci tumorózní tkáně. NK bb patří mezi lymfocyty. Pro imunologii reprodukce jsou významnější ty buňky, kterou nesou na sobě znak CD56+ a CD16+. Míra cytotoxicity závisí na expresi znaků. NK bb mají také regulační funkci za podpory T-regulačních lymfocytů a dendritických buněk, jsou zvýšené v době implantace a jejich cytotoxický charakter může být umocněn v případě převahy Th1 buněčné odpovědi [3, 4]. Prosperující gravidita vyžaduje vybalancovaný poměr těchto buněk. NK bb mají tedy regulační i efektorové funkce (např. rejekce transplantátu apod.). Dnes už se ví [1, 2, 4, 8, 9], že např. podle denzity exprese znaků můžeme určit NK bb s vysokou mírou cytotoxicity nebo naopak velmi malou. NK bb mohou mít na sobě celou řadu znaků, my jsme si vybrali pro naši studii NK buňky exprimující znaky CD56+ a CD16+. Tyto znaky jsme použili ke screeningovému průkazu NK bb v klidovém sekrečním endometriu pacientek opakovaně potrácejících.

Habituální potrácení (RSA) může mít multifaktoriální příčinu (genetickou, hormonální, anatomickou, infekční, hematologickou, psychogenní, ale i imunologickou). Z imunologické příčiny velmi často diagnostikujeme antifosfolipidový syndrom, buď primární, nebo sekundární. Multifaktoriální příčina bývá častější a je cíleně léčena. I přes pečlivou léčbu ale může dojít k opakované ztrátě, která je už indikací k určení endometriálních NK bb, na něž se nyní zaměřujeme.

SOUBOR PACIENTEK A METODIKA

Z Poradny pro imunologiii reprodukce při Genetice-Plzeň, s.r.o., jsme po podepsaném informovaném souhlasu pečlivě vybrali 59 žen ve věku 25–41 (průměr 34) let, které měly tři až devět těhotenských ztrát v podobě dg. spontánní potrat nebo missed abortion a které jsme dále vyšetřovali pomocí diagnostické hysteroskopie. Z dalších anamnestických údajů jsme se zaměřili na délku období užívání hormonální antikoncepce před rozhodnutím založit rodinu. Sledovali jsme i pracovní anamnézu, a to především s ohledem na stres. U těchto už z poradny náhodně vybraných pacientek jsme provedli screeningové imunologické vyšetření k potvrzení nebo vyloučení antifosfolipidového syndromu, přítomnosti vrozených trombofilních stavů a dále jsme se zaměřili na analýzu buněčné imunity cílené na identifikaci lymfocytů se znaky CD56+ a CD16+. Rozšířenou buněčnou imunitu jsme sledovali v krvi a v endometriu. Krev odebíráme v ten samý den těsně před uvedením pacientky do krátké anestezie s analgezií před časovanou hysteroskopií 22.–24.den cyklu.

Hysteroskopii provádíme diagnostickým 5mm hysteroskopem v krátké celkové anestezii, vzhledem k časté nulliparitě s volně neprostupným děložním hrdlem a vzhledem k následné abrazi endometria. Dilatace děložního hrdla není většinou nutná. Výkon provádíme v ambulantním režimu, bez nutnosti hospitalizace. Nezaznamenali jsme žádnou komplikaci hysteroskopického výkonu v tomto souboru pacientek.

Počet leukocytů a lymfocytů vyšetřujeme metodou průtokové cytometrie na přístroji Cel-dyn Ruby (v laboratoři Privamed), subpopulace lymfocytů CD3+, CD4+, CD8+, CD19+ a NK bb. CD16+ 56+ pak na přístroji Coulter Beckman (v laboratoři ÚIA FN).

Profil antifosfolipidových protilátek proti kyselině fosfatidové, fosfatidyl serinu, fosfatidylinositolu, fosfatidylglycerolu, fosfatidyletanolaminu, proti beta-glykoproteinu 1, kardiolipinu, annexinu V v izotypech IgG a IgM vyšetřujeme pomocí konvenční ELISA metody.

Imunohistochemická vyšetření děložní sliznice připravované klasicky z parafinových řezů jsme provedli pomocí myší monoklonální protilátky CD16 a CD56 (NovocastraTM firmy Leica Microsystems GmbH, Velká Británie). Současně sledujeme v tkáni korporálního endometria i hormonální odezvu.

VÝSLEDKY

Z anamnéz pacientek jsme se dozvěděli, že hormonální antikoncepci (HAK) neužívalo nikdy pět žen, zbytek 2–15 let, více než 10 let užívalo hormonální antikoncepci 21 pacientek. Průměr HAK 6,9 let.

Pracovní zátěž: 15 pacietek mělo dělnickou profesi (dvě z nich pracují s chemikáliemi), 30 úřednickou dráhu, 12 žen bylo vysokoškolaček, z nich čtyři lékařky s pravidelnými 4–12 nočními službami do měsíce.

APA syndrom byl přítomný u 18/57.

Leidenskou mutaci, homozygotní formu, jsme diagnostikovali celkem u tří pacientek.

Buněčná imunita v krvi u všech sledovaných pacientek vykazovala zcela normální rozložení lymfocytů pro znaky CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, CD16+, CD56+.

Tabulka 1 prezentuje nález endometriálních NK bb CD56+ a NK bb CD16+. Nalezli jsme vysokou denzitu NK bb CD56+ u 41/57, a NK bb CD16+ u 40/57, oboje NK bb CD56+ a NK bb CD16+ pozitivní nálezy pak u 36/56. U 13/57 jsme zvýšenou denzitu sledovaných NK bb ve sliznici děložní nenalezli.

Obrázky 1 a 2 zobrazují mikroskopický nález sledovaných lymfocytů v endometriu sekreční fáze cyklu.

DISKUSE

Patologický nález periferních NK bb a endometriálních NK bb v animálním i lidském modelu je spojován se selháním reprodukce [8]. Na druhou stranu, NK bb obecně jsou velmi důležité v procesu implantace, v období decidualizace, participují na placentární invazi, usnadňují vaskularizaci za pomoci dalších imunologických faktorů, jako jsou makrofágy, dendritické buňky, které de facto modulují imunitní systém do odpovědi Th2/Treg. Je prokázáno [12], že nerovnováha v lokální buněčné imunitě může vést k porušení imunologické tolerance, k nastolení zvýšené fagocytární aktivity a přesmyku na Th1/Th17 [3], a tím i k nárůstu embryocytotoxických cytokinů, především TNFα a INFγ. Byla opakovaně prokazovaná zvýšená aktivita endometriálních NK bb právě u žen s opakovaným selháváním implantace, ale i ztráty časných plodů [15].

Někteří autoři [11] považují jen zvýšené hladiny periferních NK bb CD16+ za původce opakovaného implantačního selhávání s tím, že periferní NK indukují vznik endometriálních NK bb. Jiní autoři [13] informují o tom, že není významný rozdíl mezi počtem NK bb, B a T lymfocytů v porovnání s výsledkem léčby IVF a výsledkem prosperujících gravidit. Upozorňují i na to, že pacientky, které měly vysoké NK bb v krvi, neměly vyšší počet předchozích těhotenských ztrát po in vitro fertilizaci ve srovnání s pacientkami, které měly hladiny periferních NK bb zcela normální.

Je jasné, že zánětlivá imunitní reakce ovládaná právě buněčnou (NK bb) imunitou sehrává klíčovou úlohu při poruchách reprodukce (selhávání implantace, potraty). Je-li dysregulace mezi NK bb a T lymfocyty právě v endometriu, pak dochází ke vzniku cytotoxického prostředí přímo v děloze a tento stav pak vede ke zhoršené proliferaci a diferenciaci trofoblastu, porušení angiogeneze a zvýšenému oxidativnímu stresu v důsledku lokálních ischemických změn. U žen, které opakovaně potrácejí, jsou velmi časté abnormality T buněk se zvýšenou odpovědí Th1 a Th17 a sníženou Th2 [3, 6]. Lee et al. [7] prokázal, že u 76 % pacientek s prozatím idiopatickým opakovaným potrácením mělo v diferenciaci buněčné imunity velké odchylky právě směrem k nepříznivé Th1 buněčné odpovědi.

Prokázali jsme, že endometriální NK buňky jsou přítomné v různé hustotě i v „netěhotném“ endometriu. Tyto buňky proliferují v sekreční fázi během menstruačního cyklu [8, 9], během úspěšné implantace se ještě dál opakovaně množí, prakticky do konce prvního trimestru jako NK bb značené CD56^bright a CD16+. Jejich původ je zahalen několika hypotézami, které ale zasahují do vysoce podrobných imunologických úvah, prakticky nad rámec našeho praktického sdělení.

Jedna z posledních prací [5] podtrhuje tu skutečnost, že periferní i endometriální NK bb se mohou výrazně odlišovat podle jejich receptorové exprese, množství a aktivity. Studie se zaměřila na sledování periferních počtů buněk se znaky CD45+, CD3+, CD56+, CD16+ průtokovou cytometrií a imunohistochemicky sledovala přítomnost NK bb CD56+ v endometriu luteální fáze u 268 žen po jednom, dvou a třech potratech. Studie porovnávala jednotlivé subsety s tím, že prokázala vyšší počty hodnoty periferních lymfocytů CD45 + CD3-DR + (p <0,01) a CD45 + CD3 + CD8 + DR + (p = 0,04), které byly spojeny s vyššími počty endometriálních NK bb. Studie ale neprokázala jednoznačnou spojitost mezi periferními a lokálními NK bb, ale domněnku, že by snad aktivované NK bb, B a T lymfocyty mohly poskytovat cytokiny pro diferenciaci endometriálních NK bb. Naše předběžné výsledky ale poukazují na to, že perifení NK bb jsou odlišné od děložních. Podle Vassiliadou et al. [15] dochází u potrácivých k narušení imunologické tolerance mezi matkou a plodem právě ve prospěch cytotoxických NK bb CD56^dim. I když nemáme zatím možnost určit jemnou diferenciaci uterinních NK bb CD56^bright od CD56^dim (jedná se o zcela odlišné funkce), přece jenom se domníváme, že nápadně zvýšená denzita endometriálních obecně NK bb CD56+ a CD16+ informuje o vystupňované lokální buněčné imunitě v luteální fázi endometria, která může sehrávat důležitou roli i v implantaci a v průběhu časné gravidity. Kdyby se jednalo o imunogenní aktivitu směrovanou k toleranci matka-plod a ne k proliferaci prozánětlivých buněk a jejich faktorů, pak by pacientka opakovaně nepotrácela z důvodu právě imunologického selhávání.

Tang et al. [12] provedl analýzu 783 publikací z let 1950–2010 a zaměřil se na studie právě endometriálních a periferních NK bb, na jejich hustotu s ohledem na idiopatickou infertilitu. V rozboru prací vyčítá autorům, že laboratorní diagnostika abnormální hustoty NK bb, následný potrat nebo jeho rekurence směrovaná k léčbě, není dokumentovaná právě výsledkem, tedy úspěšnou graviditou. Tato kompilátní práce [12] přímo vyzývá k dalším studiím, jež potvrdí, nebo vyvrátí úlohu hodnocení NK bb, které jsou prediktivním screeningem pro cílenou imunoterapii u žen se sníženou plodností.

Jiné studie [10] vyzdvihují přednosti NK bb (sekrece i „hodných“ cytokinů, účast na angiogenezi apod.) v preimplantačním endometriu, především časné těhotenské deciduy. Upozorňuje však i na to, že zvýšená nadprodukce uterinních NK bb se snoubí se selháváním gravidity. Domnívá se, že tato patologická situace je dobře ovlivnitelná kortikoidní terapií. I tato studie vyzývá ke sledování endometriálních NK bb, kterými můžeme odhalit imunologický defekt v endometriu včas a který nás nasměruje k cílené budoucí léčbě pacientky.

V naší prezentované skupině infertilních pacientek téměř třetina z nich užívala hormonální antikoncepci více než 10 let, u většiny z nich jsme diagnostikovali ještě navíc antifosfolipidový syndrom, stres a jinou profesionální zátěž, která může narušit synchronizaci neuro-endokrinně imunitního systému. Multifaktoriální příčina snížené plodnosti v nastolení získané autoimunitní patologie ještě více prohlubuje problém buněčné a protilátkové imunity [14]. Vhodně stanovenou imunomodulační léčbou cílenou na NK bb a jiné faktory a výsledky našich pacientek sledovaných v této studii budeme publikovat v následujícím článku.

ZÁVĚR

Prokázali jsme důležitý fakt, že počty periferních NK bb nekorelují s hustotou endometriálních NK bb. Z našeho perspektivního sledování infertilních pacientek vyplývá, že endometriální NK bb sehrávají důležitou úlohu nejen fyziologickou, ale při vysoké hustotě i patologickou v podobě nadprodukce embryocytotoxických cytokinů [1].

Prof. MUDr. Zdenka Ulčová-Gallová, DrSc.

Genetika-Plzeň, s.r.o.

305 00 Plzeň

e-mail: ulcova-gallova@email.cz