Chromozom 21 – specifické mikroRNA v mateřské cirkulaci: zhodnocení jejich významu pro screening Downova syndromu u plodu
Authors:
I. Hromadníková 1; K. Kotlabová 1; J. Doucha 2; D. Chudoba 3; P. Calda 4; K. Dlouhá 5
Authors‘ workplace:
Oddělení molekulární biologie a patologie buňky, Gynekologicko-porodnická klinika, 3. LF UK, Praha, přednosta kliniky doc. MUDr. E. Kučera, CSc.
1; Gynekologicko-porodnická klinika, FN Motol a 2. LF UK, přednosta kliniky prof. MUDr. L. Rob, CSc.
2; Oddělení lékařské cytogenetiky, Ústav biologie a lékařské genetiky, FN Motol a 2. LF UK, přednosta ústavu prof. MUDr. M. Macek jr., DrSc.
3; Gynekologicko-porodnická klinika, VFN a 1. LF UK, Praha, přednosta kliniky prof. MUDr. A. Martan, DrSc.
4; Ústav pro péči o matku a dítě, Praha, ředitel ústavu doc. MUDr. J. Feyereisl, CSc.
5
Published in:
Ceska Gynekol 2012; 77(5): 395-402
Overview
Cíl studie:
Cílem této studie bylo zjistit, zda je možné detekovat v mateřské cirkulaci expresi genů přítomných na chromozomu 21, které kódují mikroRNA (miR-99a, let-7c, miR-125b-2, miR-155 a miR-802). Následně bylo cílem této studie zhodnotit, zda se budou plazmatické koncentrace a expresní profil chromozom 21 specifických mikroRNA lišit mezi těhotenstvím s euploidním a aneuploidním plodem (Downův syndrom).
Typ studie:
Pilotní studie.
Název a sídlo pracoviště:
Oddělení molekulární biologie a patologie buňky, Gynekologicko-porodnická klinika, 3. lékařská fakulta, Univerzita Karlova v Praze.
Metodika:
Celkem bylo retrospektivně testováno 12 těhotných žen s fyziologickým průběhem gravidity (průměr 16,4 týdne, medián 16. týden), 12 těhotných žen s potvrzeným Downovým syndromem u plodu (průměr 18,2 týdne, medián 18,5 týdne) a 6 zdravých žen bez známek těhotenství. Z 1 ml plazmy byla izolována RNA obohacená o frakci malých RNA (včetně mikroRNA). Následně byla příslušná mikroRNA přepsána do cDNA pomocí specifického stem-loop primeru a detekována pomocí PCR v reálném čase.
Výsledky:
Komerční systémy umožnily spolehlivě detekovat 4 z 5 extracelulárních chromozom 21 specifických mikroRNA (miR-99a, let-7c, miR-125b-2 a miR-155). Expresní profil extracelulárních miR-99a, miR-125b-2 a miR-155 se významně lišil mezi souborem těhotných a netěhotných žen. Také plazmatické hladiny miR-99a a miR-125b-2 byly významně vyšší u těhotných žen. Plazmatické koncentrace a genová exprese extracelulárních chromozom 21 specifických mikroRNA (miR-99a, let-7c, miR-125b-2 a miR-155) se nelišily mezi souborem těhotných žen s euploidním a aneuploidním plodem.
Závěr:
Analýza extracelulárních chromozom 21 specifických mikroRNA neumožňuje rozlišení mezi těhotenstvími s euploidním a aneuploidním plodem, a nemá tudíž žádný přínos pro screeningový program.
Klíčová slova:
Downův syndrom, genová exprese, mikroRNA, PCR v reálném čase, placenta.
ÚVOD
MikroRNA (miRNA) jsou krátké jednořetězcové molekuly (18 až 25 nukleotidů) [16, 17], jež se významně podílejí na posttranskripční regulaci genové exprese [4, 5, 12, 17], nejčastěji inhibicí translace mRNA [5] s následným útlumem proteosyntézy, méně obvykle pak přímou degradací mRNA [10, 21, 22, 26].
MikroRNA jsou zodpovědné za řízení klíčových biologických dějů, jako je buněčný vývoj, diferenciace, proliferace, apoptóza a mezibuněčná komunikace [1, 11, 14, 23]. Podle údajů miRBase databáze (http://www.mirbase.org) bylo doposud v lidském genomu identifikováno přibližně 1500 různých mikroRNA (tento počet se stále rozrůstá), přičemž každý typ mikroRNA reguluje genovou expresi desítek až stovek genů [16, 18, 19].
Vzhledem k široké paletě dějů, které mikroRNA v organismu ovlivňují, je věnována velká pozornost výzkumu identifikace charakteristických profilů mikroRNA u jednotlivých onemocnění a jejich potenciální využití pro diagnosticko-prognostické a terapeutické účely.
Naše nedávno uskutečněné pilotní studie popsaly přítomnost placentárně specifických mikroRNA v mateřské cirkulaci, jejichž signifikantní nárůst plazmatických hladin a genové exprese reflektoval postupný nárůst placentární tkáně s progresí gravidity [6, 13]. Naše předběžné výsledky rovněž poukázaly na možnost využití placentárně specifických mikroRNA jako potenciálních molekulárních biomarkerů pro detekci placentární insuficience a predikci těhotenských komplikací asociovaných s placentární nedostatečností (preeklampsie a intrauterinní růstová retardace) [7]. Předpokládáme, že stejně jako fetální DNA a placentární transkripty (mRNA) budou i placentárně specifické mikroRNA součástí apoptotických tělísek placentárního trofoblastu, které se kontinuálně vyplavují do mateřské cirkulace v důsledku remodelace placenty [9]. Extracelulární nukleové kyseliny přítomné v mateřské cirkulaci navozují tzv. dočasný fetální mikrochimérismus, specifický pro dané těhotenství a pro daný plod. Tohoto fenoménu je možno využít pro neinvazivní určení genetických informací plodu (např. pohlaví, RHD a RHCE genotyp plodu) [9]. Pomocí sekvenování nové generace (masivní paralelní sekvenování) extracelulární směsné DNA (majoritní podíl maternální DNA s přibližně 1% příměsí fetální DNA) přítomné v mateřské cirkulaci lze určit i přítomnost Downova syndromu u plodu [2, 3]. Tato převratná technologie, pomocí níž byla stanovena kompletní sekvence lidského genomu (Human Genome Project), bude zcela nepochybně využívána v budoucnu rutinně v rámci screeningových programů pro identifikaci chromozomálních aneuploidií u plodu. V současné době však ještě nejsou vyvinuty finální algoritmy pro spolehlivou neinvazivní diagnostiku Downova syndromu a algoritmy pro diagnostiku ostatních chromozomálních aneuploidií jsou předmětem intenzivního výzkumu. Před vlastní implementací sekvenování nové generace do rutinního prenatálního screeningu je třeba provést spolehlivé zhodnocení metodiky, zejména s ohledem na některé doposud opomíjené aspekty (vliv placentárního mozaicismu, mozaiková forma Downova syndromu, vícečetné těhotenství). Také by bylo vítáno zlevnění této technologie, která je nyní stále ještě velmi ekonomicky nákladná pro rutinní screening, vezmeme-li v úvahu vysokou částku vstupní investice a provozní náklady na jedno vyšetření.
Alternativně jsme se v této pilotní studii zaměřili na detekci mikroRNA (miR-99a, let-7c, miR-125b-2, miR-155 a miR-802), jejichž geny jsou lokalizovány na lidském chromozomu 21, v mateřské cirkulaci. Cílem této studie bylo zhodnotit, zda se budou plazmatické koncentrace a expresní profil chromozom 21 specifických mikroRNA lišit mezi těhotenstvím s euploidním a aneuploidním plodem (Downův syndrom).
SOUBOR PACIENTEK
Celkem bylo retrospektivně testováno 12 těhotných žen s fyziologickým průběhem gravidity v rozmezí mezi 12. a 25. gestačním týdnem (průměr 16,4 týdne, medián 16. týden), 12 těhotných žen s potvrzeným Downovým syndromem u plodu v rozmezí mezi 12. a 22. gestačním týdnem (průměr 18,2 týdne, medián 18,5 týdne) a 6 zdravých žen bez známek těhotenství. Všechny pacientky poskytly informovaný souhlas s odběrem periferní krve pro toto vyšetření.
METODIKA
Izolace plazmy z periferní krve matky
Plazma byla připravena z 1 ml nesrážlivé periferní krve (EDTA) nejpozději 24 hodin po odběru centrifugací při 1200 g po dobu 10 minut. Poté byla plazma stočena znovu a skladována při -80 °C až do dalšího zpracování [6, 7, 13].
Abychom minimalizovali riziko kontaminace vzorků, prováděli jsme veškeré zpracování biologického materiálu v laminárním boxu třídy II a pro pipetaci jsme používali aerosol rezistentní špičky.
Izolace mikroRNA z mateřské plazmy a přepis do cDNA
Jeden ml mateřské plazmy byl inkubován s 3 ml Trizol LS Reagent (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, USA) po dobu 5 minut při pokojové teplotě. Po 10 minutách inkubace při pokojové teplotě s 0,8 ml chloroformu následovala 15minutová centrifugace při 12 000 g a 4 °C. Vodná fáze byla přenesena do nové zkumavky a RNA byla vysrážena po přidání 1/3násobku objemu 100 % ethanolu. Následně byla získána RNA obohacená o frakci malých RNA pomocí mirVana miRNA Isolation Kitu (Ambion, Austin, Texas, USA) podle originálního protokolu výrobce. RNA byla eluována 100 μl elučního pufru. Reziduální DNA byla odstraněna pomocí 5 μl DNAázy (Dnase I, Fermentas International, Ontario, Canada).
Celkem 6,7 μl eluátu bylo použito pro přepis RNA do cDNA s využitím specifického komerčního „stem-loop“ primeru pro konkrétní mikroRNA a TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kitu (Applied Biosystem, Branchburg, New Jersey, USA) za následujících podmínek 30 minut 16 °C, 30 minut 42 °C, 5 minut 85 °C a 15 minut 4 °C na 7500 real-time PCR system (Applied Biosystem, Branchburg, New Jersey, USA). Koncentrace a čistota celkové RNA a RNA obohacené o frakci malých RNA byla stanovena na spektrofotometru NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA) [6, 7, 13].
Detekce mikroRNA v mateřské plazmě pomocí PCR v reálném čase
Detekce byla provedena na 7500 real-time PCR system (Applied Biosystem, Branchburg, New Jersey, USA) s využitím TaqMan Universal PCR Master Mixu a komerčních setů pro jednotlivé mikroRNA obsahujících specifické primery a 5’- FAM, 3’- MGB značenou sondu (Applied Biosystem, Branchburg, New Jersey, USA) v reakčním objemu 35 μl s 4,4 μl cDNA. Podmínky PCR reakce byly nastaveny podle manuálu výrobce (10minutová preinkubace při 95 °C nutná pro aktivaci AmpliTaq Gold DNA polymerázy; dále 40 cyklů při 95 °C 15 s (denaturace DNA) a 60 °C 1 min (anelace a syntéza DNA). Každý vzorek byl analyzován v 8jamkových stripech ve 3 replikátech. Pozitivní výsledek byl hodnocen jako detekce fluorescenčního signálu v jamce před 40. cyklem (Ct < 40). Jako pozitivní kontrola byla využita frakce RNA obohacená o mikroRNA izolovaná z fetální části placenty. Každá analýza zahrnovala negativní kontroly (bez přítomnosti cDNA templátu a/nebo reverzní transkriptázy). Orientační koncentrace jednotlivých mikroRNA v mateřské plazmě byly odečteny ze standardních křivek a vyjádřeny jako koncentrace celkové RNA obohacené o frakci malých RNA v pg/ml mateřské plazmy [6, 7,1 3]. Genová exprese jednotlivých chromozom 21 specifických mikroRNA (let-7c, miR-99a, miR-125b-2, miR-155 a miR-802) v mateřské plazmě byla hodnocena metodou komparativní Ct metody [20] vůči normalizačnímu faktoru (geometrický průměr Ct hodnot endogenních kontrol: miR-16 a let-7d) [7, 13, 25].
Statistická analýza
Plazmatické koncentrace a genová exprese jednotlivých mikroRNA byly porovnány mezi jednotlivými soubory pomocí Mannova-Whitneyho U testu a Studentova t-testu pomocí Statistica softwaru (StatSoft, Inc., USA). Rozdíly mezi jednotlivými skupinami byly považovány za statisticky významné v případě p < 0,05. Data absolutní a relativní kvantifikace jednotlivých mikroRNA jsou znázorněna ve formě krabicových grafů s vyznačením mediánů, percentilů 75 a 25, maximálních a minimálních hodnot.
VÝSLEDKY
Detekce jednotlivých chromozom 21 specifických mikroRNA v cirkulaci těhotných žen a zdravých žen bez známek těhotenství
Detekce chromozom 21 specifických mikroRNA byla nejprve ověřována na vzorcích RNA obohacených o frakci malých RNA izolovaných z fetální části placenty. Všech 5 chromozom 21 specifických mikroRNA (miR-99a, let-7c, miR-125b-2, miR-155, miR-802) bylo úspěšně detekováno v placentární tkáni v rozmezí 16,0 až 24,0 cyklu, avšak amplifikace miR-802 se objevovala na neobvykle pozdních cyklech (kolem Ct 32,0), což naznačovalo, že tento detekční systém není optimálně navržen (obr. 1A).
Následně komerční systémy spolehlivě detekovaly v plazmatických vzorcích expresi 4 z 5 mikroRNA (miR-99a, let-7c, miR-125b-2 a miR-155), jejichž geny jsou lokalizovány na lidském chromozomu 21. Systém pro detekci miR-802 byl bohužel podle předpokladu nefunkční (tab. 1, obr. 1B).
Výběr vhodných endogenních kontrol pro normalizaci dat u studia genové exprese extracelulárních mikroRNA
Celkem byly v plazmě těhotných žen a žen bez známek těhotenství testovány 4 endogenní kontroly, které jsou doporučovány pro normalizaci dat u sledování genové exprese malých RNA molekul v buněčných kulturách a tkáních (mikroRNA: miR-16 a let-7d, malá jaderná RNA: RNU6B a malá jadérková RNA: RNU24). RNU6B a RNU24 byly ve všech vyšetřovaných vzorcích plazmy nedetekovatelné, a nemohou být tudíž využity jako endogenní kontroly pro normalizaci dat (tab. 1). Hladiny obou extracelulárních mikroRNA (miR-16 a let-7d) byly srovnatelné mezi soubory těhotných žen s euploidním a aneuploidním plodem, proto byly vybrány pro následné hodnocení genové exprese extracelulárních chromozom 21 specifických mikroRNA (obr. 2). S ohledem na doporučení byla genová exprese chromozom 21 specifických mikroRNA v plazmatických vzorcích těhotných a netěhotných žen vyhodnocena vůči normalizačnímu faktoru (geometrický průměr Ct hodnot endogenních kontrol: miR-16 a let-7d) [25].
Hladiny a genová exprese extracelulárních chromozom 21 specifických mikroRNA v cirkulaci těhotných a netěhotných žen
Plazmatické hladiny miR-99a a miR-125b-2 byly významně vyšší u těhotných žen v porovnání se souborem žen bez známek těhotenství (obr. 3). Expresní profil extracelulárních miR-99a, miR-125b-2 a miR-155 se významně lišil mezi souborem těhotných a netěhotných žen (obr. 4). Překvapivě let-7c nerozlišila ani v absolutní, ani v relativní kvantifikaci soubor těhotných a netěhotných žen (obr. 3 a 4).
Plazmatické koncentrace a genová exprese extracelulárních chromozom 21 specifických mikroRNA (miR-99a, let-7c, miR-125b-2 a miR-155) se nelišily mezi souborem těhotných žen s euploidním a aneuploidním plodem (obr. 3 a 4).
DISKUSE
V této pilotní studii jsme se zaměřili na vývoj metodiky pro detekci chromozom 21 specifických mikroRNA (miR-99a, let-7c, miR-125b-2, miR-155 a miR-802) v mateřské cirkulaci pomocí PCR v reálném čase. Každá mikroRNA byla specificky přepsána do cDNA pomocí tzv. sekvenčně specifického „stem-loop“ primeru. Ta byla následně detekována pomocí sekvenčně specifických primerů a MGB (minor groove binder) sondy. Současné možnosti umožnily spolehlivě detekovat 4 z 5 extracelulárních chromozom 21 specifických mikroRNA (miR-99a, let-7c, miR-125b-2 a miR-155).
Extracelulární chromozom 21 specifické mikroRNA byly dobře detekovatelné v plazmatických vzorcích žen bez známek těhotenství, zřejmě jako součást apoptotických tělísek hematopoetických buněk vznikajících v důsledky obnovy krvetvorby.
Podle předpokladu byly u těhotných žen v porovnání se souborem žen netěhotných nalezeny signifikantně vyšší koncentrace některých mikroRNA (miR-99a a miR-125b-2) v mateřské cirkulaci. Naopak plazmatické hladiny let-7c a miR-155 se nelišily mezi soubory těhotných a netěhotných žen. Analýza genové exprese odhalila signifikantně vyšší hladiny miR-99a, miR-125b-2 a miR-155 u těhotných žen. V případě těhotenství přispívají k extracelulárním nukleovým kyselinám svým dílem nejprve chorion a později placenta. Při optimální placentaci je proliferace placentárního trofoblastu adekvátně vyvážena jeho apoptózou [9]. Apoptotická tělíska placentárního trofoblastu jsou nositeli cirkulujících nukleových kyselin (fetální DNA, placentární transkripty a mikroRNA) před tím, než jsou z mateřské cirkulace odstraněna mateřskými makrofágy [9]. Proto hladiny některých cirkulujících nukleových kyselin mohou být v těhotenství v mateřské cirkulaci signifikantně zvýšeny.
Cílem této studie bylo zhodnotit, zdali se budou plazmatické hladiny a expresní profil chromozom 21 specifických mikroRNA lišit mezi těhotenstvím s euploidním a aneuploidním plodem (Downův syndrom). Jde o první studii tohoto druhu. Experimenty pracovní skupiny Kuhn et al. provedené na malém souboru demonstrovaly zvýšenou expresi chromozom 21 specifických mikroRNA (miR-99a, let-7c, miR-125b-2, miR-155 a miR-802) ve tkáních fetálního hipokampu a srdce u většiny plodů postižených Downovým syndromem ve srovnání s kontrolními plody srovnatelného gestačního stáří [15]. Autoři rovněž vyslovili hypotézu, že overexprese těchto mikroRNA přítomná v důsledku trizomie 21 vede k downregulaci specifických cílových proteinů, jenž je ve svém důsledku zodpovědná za specifický fenotyp u pacientů s Downovým syndromem [15]. Výsledky naší studie odhalily, že se ani plazmatické koncentrace, ani expresní profil extracelulárních chromozom 21 specifických mikroRNA (miR-99a, let-7c, miR-125b-2, miR-155) neliší mezi soubory těhotných žen s euploidním a aneuploidním plodem. Tento fakt je zřejmě možné vysvětlit tím, že exprese chromozom 21 specifických mikroRNA se v placentární tkáni neliší mezi těhotenstvími s euploidními a aneuploidními plody. Přestože jsou ve fetální části placentární tkáně u těhotenství s trizomií 21 u plodu přítomny nepochybně 3 geny kódující danou mikroRNA, překvapivě se neprojeví tento kvantitativní rozdíl v genové dávce ani v absolutní, ani v relativní kvantifikaci, je-li srovnáván s těhotenstvími s euploidními plody. Je také prokázáno, že apoptóza placentárního trofoblastu není ovlivněna postižením plodu Downovým syndromem, neboť ve stejném gestačním období byly detekovány v mateřské cirkulaci srovnatelné hladiny fetální DNA v porovnání s kontrolním souborem [8, 24].
ZÁVĚR
Přestože je analýza extracelulárních chromozom 21 specifických mikroRNA realizovatelná a snadno dostupná specializované molekulárně genetické laboratoři, neumožňuje rozlišení mezi těhotenstvími s euploidním a aneuploidním plodem, a nemá tudíž žádný přínos pro screeningový program.
Poděkování
Tato práce vznikla za podpory projektu GAUK č. 434011.
Autoři by rovněž rádi poděkovali Mgr. Lence Veselovské za pomoc při zpracování biologického materiálu.
Doc. RNDr. Ilona Hromadníková, PhD.
Oddělení molekulární biologie a patologie buňky
3. LF UK
Ruská 87
100 00 Praha 10
e-mail: ilona.hromadnikova@lf3.cuni.cz
Sources
1. Calin, GA., Dumitru, CD., Shimizu, M., et al. Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99 (24), p. 15524–15529.
2. Ehrich, M., Deciu, C., Zwiefelhofer, T., et al. Noninvasive detection of fetal trisomy 21 by sequencing of DNA in maternal blood: a study in a clinical setting. Am J Obstet Gynecol, 2011, 204, (3), 205.e1–11.
3. Fan, HC., Blumenfeld, YJ., Chitkara, U., et al. Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105 (42), p. 16266–16271.
4. Grishok, A., Pasquinelli, AE., Conte, D., et al. Genes and mechanisms related to RNA interference regulate expression of the small temporal RNAs that control C. elegans developmental timing. Cell, 2001, 106, p. 23–34.
5. Hammond, SM., Bernstein, E., Beach, D., et al. An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature, 2000, 404, p. 293–296.
6. Hromadníková, I., Kotlabová, K., Jirásek, JE., et al. Detekce placentárně specifických mikroRNA v mateřské cirkulaci. Čes Gynek, 2010, 75, s. 252–256.
7. Hromadnikova, I., Kotlabova, K., Doucha, J., et al. Absolute and relative quantification of placenta-specific microRNAs in maternal circulation with placental insufficiency-related complications. J Mol Diagn, 2012, Jan 14, [Epub ahead of print].
8. Hromadnikova, I., Houbova, B., Hridelova, D., et al. Quantitative analysis of DNA levels in maternal plasma in normal and Down syndrome pregnancies. BMC Pregnancy Childbirth, 2002, 28, 2 (1), p. 4.
9. Hromadníková, I. Současné možnosti neinvazivní prenatální diagnostiky na bázi extracelulárních nukleových kyselin v mateřské cirkulaci. Gynekolog, 2010, 2, s. 57–62.
10. Hutvágner, G., Zamore, PD. A microRNA in a multiple-turnover RNA enzyme complex. Science, 2002, 297, p. 2056–2060.
11. Chen, CZ., Li, L., Lodish, HF., et al. MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation. Science, 2004, 303 (5654), p. 83–86.
12. Ketting, RF., Fischer, SE., Bernstein, E., et al. Dicer functions in RNA interference and in synthesis of small RNA involved in developmental timing in C. elegans. Genes Dev, 2001, 15, p. 2654–2659.
13. Kotlabova, K., Doucha, J., Hromadnikova, I. Placental-specific microRNA in maternal circulation-identification of appropriate pregnancy-associated microRNAs with diagnostic potential. J Reprod Immunol, 2011, 89, p. 185–191.
14. Krichevsky, AM., King, KS., Donahue, CP., et al. A microRNA arrays reveals extensive regulation of microRNAs during brain development. RNA, 2003, 9 (10), p. 1274–1281.
15. Kuhn, DE., Nuovo, GJ., Martin, MM., et al. Human chromosome 21-derived miRNAs are overexpressed in down syndrome brains and hearts. Biochem Biophys Res Commun, 2008, 370 (3), p. 473–477.
16. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Lendeckel, W., Tuschl, T. Identification of novel genes coding for small expressed RNAs. Science, 2001, 294 (5543), p. 853–858.
17. Lau, NC., Lim, LP., Weinstein, EG., Bartel, DP. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science, 2001, 294, p. 858–862.
18. Lee, PL., Glasner, ME., Yekta, S., et al. Vertebrate microRNA genes. Science, 2003, 299 (5612), p. 1540.
19. Lewis, BP., Shih, IH., Jones-Rhoades, MW., et al. Prediction of mammalian microRNA targets. Cell, 2003, 115 (7), p. 787–798.
20. Livak, KJ., Schmittgen, TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods, 2001, 25, p. 402–408.
21. Llave, C., Xie, Z., Kasschau, KD., Carrington JC. Cleavage of Scarecrow-like mRNA targets directed by a class of Arabidopsis miRNA. Science, 2002, 297, p. 2053–2056.
22. Martinez, J., Patkaniowska, A., Urlaub, H., et al. Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi. Cell, 2002, 110, p. 563–574.
23. Michael, MZ., O’Connor, SM., van Holst Pellekaan, NG., et al. Reduced accumulation of specific microRNAs in colorectal neoplasia. Mol Cancer Res., 2003, 1 (12), p. 882–891.
24. Ohashi, Y., Miharu, N., Honda, H., et al. Quantitation of fetal DNA in maternal serum in normal and aneuploid prenancies. Hum Genet, 2001, 108 (2), p. 123–127.
25. Vandesomple, J., De Preter, K., Pattyn, F., et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genom Biol, 2002, 3, RESEARCH0034.
26. Zamore, PD., Tuschl, T., Sharp, PA., Bartel, DP. RNAi : double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell, 2000, 101 (1), p. 25–33.
Labels
Paediatric gynaecology Gynaecology and obstetrics Reproduction medicineArticle was published in
Czech Gynaecology
![Issue 5](https://www.prolekare.cz/media/cache/resolve/journal_issue/media/image_pdf/982137230b3dcd41d7534c41fcf436c5.jpeg)
2012 Issue 5
Most read in this issue
- Výsledky operační léčby sestupu přední poševní stěny s použitím polypropylenové síťky
- HE4 - biomarker ovariálního karcinomu
- Ektopická gravidita při IUS (Mirena) – kazuistika
- Výskyt Chlamydia trachomatis při léčbě neplodnosti