Stanovenie expresie p16^INK4A mRNA transkriptu v steroch z krčka maternice s rôznymi stupňami cervikálnej dysplázie

Download PDF English version

Authors: V. Janušicová ^1,2; I. Kapustová ¹; P. Žúbor ¹; P. Slezák ³; K. Kajo ⁴; Z. Lasabová ²; L. Plank ⁴; J. Danko ¹
Authors‘ workplace: Gynekologicko-pôrodnícka klinika JLF UK a UNM, Martin, prednosta prof. MUDr. J. Danko, CSc. ¹; Ústav molekulovej biológie JLF UK a UNM, Martin, prednosta RNDr. Z. Lasabová, PhD. ²; Ústav normálnej a patologickej fyziológie, SAV, Bratislava, prednosta RNDr. O. Pecháňová, DrSc. ³; Ústav patologickej anatómie JLF UK a UNM, Martin, prednosta prof. MUDr. L. Plank, CSc. ⁴
Published in: Ceska Gynekol 2012; 77(3): 245-250

Overview

Cieľ práce:
Zistiť prítomnosť HPV infekcie a hladiny expresie p16^INK4A mRNA transkriptov v cervikálnych steroch ako prídavný biomarker na detekciu cervikálnej intraepiteliálnej neoplázie alebo rakoviny.

Typ práce:
Prospektívna pilotná klinická štúdia zhodnocujúca klinickú utilitu a validitu ddCt metódy na qPCR mRNA expresiu p16^INK4A v porovnaní s imunohistochémiou.

Názov a sídlo pracoviska:
Ústav molekulovej biológie, Gynekologicko-pôrodnícka klinika, Jesseniova lekárska fakulta, Univerzita Komenského, Martin, Slovenská Republika.

Metodika:
Cervikálne stery (OC) od pacientok s odlišným stupňom cervikálnej lézie (L-SIL, H-SIL, SCA, n=45) a od zdravých kontrol (n=45) boli testované na prítomnosť HPV infekcie a p16^INK4A mRNA transkriptov použitím relatívnej kvantifikácie (RQ). Výsledky boli porovnané s H&E a IHC histologickým vyšetrením biopsií (konizácia, hysterektómia).

Výsledky:
HPV 16 sa najčastejšie vyskytoval (53,3%) v skupine pacientok s cervikálnou dyspláziou. Analýza p16^INK4A mRNA expresie preukázala slabo redukovanú expresiu v L-SIL skupine, 4-násobne zvýšenú expresiu v H-SIL skupine a 10-násobne zvýšenú u žien so SCA v porovnaní s kontrolami. Zvýšená p16^INK4A mRNA expresia bola prítomná u 30 % L-SIL, 75 % H-SIL a 85,7 % CA. Celková senzitivita testu bola 81,8 % (95% CI: 61,92–93,7) a špecificita 60 % (95 %CI: 26,24–87,84) s PPV 84,62 % a NPV 54,55 %. Koeficient pravdepodobnosti v prípade pozitívneho výsledku testu bol 2,04 a v prípade negatívneho výsledku bol 0,31. Precíznosť diagnostickej metódy p16^INK4A expresie pomocou RQ metódy u OC sterov na predikciu p16 pozitivity u cervikálnych dysplázií bola 66,7 % pre L-SIL lézie, 59,5 % pre H-SIL lézie a 100 % pre SCA lézie (r=0,9897, p<0,0913) v porovnaní s IHC vyšetrením p16 pozitívnych nálezov na chirurgicky ošetrených vzorkách.

Záver:
Relatívnou kvantifikáciou je možné určiť hladinu p16^INK4A mRNA transkriptov v cervikálnych steroch a aktívnou karcinogenézou takmer v takej istej hladine ako IHC farbenie. Výhoda šetrenia biopsií na IHC kvalifikuje tento diagnostický postup za užitočného kandidáta v selektívnom manažmente žien s cervikálnou dyspláziou, ktorý hľadá ochranu krčka maternice a predchádza zbytočnému liečeniu.

Kľúčové slová:
p16INK4A, HR-HPV, H-SIL, L-SIL, relatívna kvantifikácia, imunohistochémia.

ÚVOD

Karcinóm krčka maternice je po karcinóme prsníka druhou najčastejšou príčinou úmrtí žien na celom svete [6, 21]. Ochorenie spôsobuje infekcia ľudskými papilomavírusmi (HPV), ktoré predstavujú najčastejšie sexuálne prenosné infekcie. Počas života príde do kontaktu s papilomavírusmi až 80 % sexuálne aktívnych ľudí, pričom najväčšiemu riziku sú vystavení mladí ľudia vo veku 15–24 rokov, ktorí sa zvyčajne prvýkrát stretnú s infekciou [20]. Zavedením organizovaného skríningu na Slovensku autori jednej epidemiologickej štúdie zistili za posledných 38 rokov stabilizovaný trend v incidencii karcinómu krčka maternice a mierne zvýšený trend v mortalite. Analýzou klinických štádií ochorenia zistili, že sa zvýšil počet pacientok s klinickým štádiom I, poklesol počet pacientok so štádiom II a počty prípadov so štádiami III a IV sú stále vysoké so stúpajúcou tendenciou. V porovnaní s ostatnými Európskymi krajinami sú tieto trendy nepriaznivé a je nevyhnutné zavedenie okamžitého organizovaného skríningu [13].

Papilomavírusy sa prenášajú takmer výlučne epitelom infikovaného jedinca a môžu sa replikovať iba vo vrstevnatom skvamóznom epiteli, pričom využívajú prirodzený diferenciačný program bazálnych keratinocytov [16]. Vírusový genóm pretrváva v bunkách v cirkulárnej forme (epizóm) a replikuje sa do nízkeho počtu kópií spoločne s bunkovými chromozómami [18]. Taktiež dochádza k expresii vírusových skorých proteínov (E6, E7, E1 a E2) v nízkej hladine [4]. E6 a E7 proteíny sú nevyhnutné pre replikáciu vírusu a sú exprimované počas produktívnej infekcie, kedy je ich regulácia prísne kontrolovaná. Ak je narušená, E6 a E7 sú v nadexpresii, môžu zrušiť normálnu funkciu tumorsupresorov (p53 a pRb) a bunky získavajú malígny fenotyp [2].

Vo vzájomnom vzťahu ku vzrastajúcej expresii onkogénnych E6/E7 mRNA je aj bunková kináza p16^INK4A. Dráha p16^INK4A proteínu je v bunkovom cykle prísne regulovaná systémom inhibítorov cyklín-dependentných kináz, spomedzi nich p16 blokuje enzýmy fosforylujúce pRb (cyklín-dependentné kinázy). V bunkách s HPV transformujúcimi infekciami je regulácia Rb-E2F dráhy rozložená E7 proteínom a aktivovaný p16 nemá downstream efekt. Výsledkom je nadexpresia p16 a proteín sa kumuluje v bunkách. Nadexpresia p16^INK4A bola dokázaná vo väčšine cervikálnych prekanceróz a karcinómov, zatiaľ čo v normálnom tkanive je vo veľmi nízkej hladine. Proteín p16 sa nespája s proliferáciou, ale skôr so starnutím bunky a zastavením bunkového cyklu (cell cycle arrest) [2]. Proteíny E6, E7 a p16 sú preto sľubnými biomarkermi pri predikcii a diagnostike prekanceróznych a rakovinových stavov s veľkým potenciálom do budúcnosti.

V našej štúdii sme sa zamerali na overenie možnosti diagnostiky p16^INK4A transkriptov v steroch z krčka maternice u pacientok s dyspláziami krčka maternice a prítomnosťou vysokorizikových HPV subtypov, ktoré následne podstúpili operačný zákrok. Rozhodli sme sa využiť nový analytický prístup založený na relatívnej kvantifikácii určovania prítomnosti bunkového p16^INK4A mRNA transkriptu oproti bunkovému housekeeping génu ACTB, ako najstabilnejšieho spomedzi ostatných génov (RPLP0, PGK1, 18S, SDHA, RPL4, GAPDH a ďalšie) v skvamóznych bunkách krčka maternice [19]. Získané výsledky a validitu takéhoto nového diagnostického testu (metóda relatívnej kvantifikácie) sme overovali porovnaním výsledkov s imunohistochemickou metódou farbenia post-operačných preparátov.

MATERIÁL A METODIKA

Pacientky

Do štúdie bolo zaradených 90 pacientok, u ktorých bol odobraný bunkový (OC) ster z krčka maternice. Z nich 45 sterov bolo od pacientok s rôznym stupňom skvamóznej intraepiteliálnej neoplázie (SIL): nízkostupňové (L-SIL), vysokostupňové (H-SIL) a skvamózne karcinómy (SCA). Zvyšok predstavoval kontrolný súbor zdravých žien (n=45), ktoré nemali dysplastické zmeny na krčku maternice a v minulosti nepodstúpili operáciu krčka maternice (tab. 1). Všetky pacientky boli poučené o prebiehajúcej štúdii a podpísali informovaný súhlas schválený Etickou komisiou JLF UK.

**Table 1. Charakteristika súboru pacientok**

Odber a transport vzoriek

Vzorky skvamózneho epitelu boli odoberané dracénovým tampónom do tekutého transportného média (Remel, Lenexa, USA), uložené do transportného chladiaceho boxu pri teplote -4 °C a použité na extrakciu nukleových kyselín (Epicentre, USA) podľa postupu výrobcu. Získané nukleové kyseliny boli uskladnené pri -20 °C do ďalšieho použitia.

Analýza DNA

Koncentrácia DNA bola stanovená spektrofotometricky a PCR reakciou bol určený HPV genotyp. Navrhli sme primery špecifické pre L1 oblasť vírusu HPV16 a HPV18, pričom sme použili podobné sekvencie ako autori Gravitt et al. v svojej štúdii z roku 2000 [7]. Ako pozitívnu kontrolu PCR reakcií sme použili DNA z bunkových línií CaSki (HPV 16 pozitívna) a HeLa (HPV 18 pozitívna). PCR produkty boli purifikované (Macherey-Nagel, Nemecko), nasledovala sekvenačná reakcia kitom BigDye Terminator v.1.1 (Applied-Biosystems, USA), postsekvenačná purifikácia (Sigma-Aldrich, Nemecko) a sekvenačná analýza na prístroji 3500 Genetic Analyser (Applied-Biosystems, USA). Všetky získané sekvencie boli porovnané s internetovou databázou BLAST.

Analýza RNA

RNA bola reverzne prepísaná do cDNA knižníc (Bio-Rad, USA) a kvalita bola prekontrolovaná pomocou real-time PCR s využitím taqman sond špecifických pre housekeeping gén GAPDH (Applied-Biosystems, USA). Pozitívne vzorky s Ct≤34 boli použité na analýzu p16^INK4A metódou relatívnej kvantifikácie (RQ) [12] na prístroji 7500 Fast Real Time PCR System (Applied-Biosystems, USA). Hladina expresie p16^INK4A transkriptu bola normalizovaná k referenčnému génu ACTB a porovnaná s kontrolnou vzorkou. Vzorky od pacientok boli rozdelené do troch skupín podľa závažnosti lézie (L-SIL, H-SIL, SCA). Expresia p16^INK4A mRNA transkriptu bola porovnaná s HPV pozitívnymi bunkovými líniami CaSki (HPV16 pozitívna), HeLa (HPV18 pozitívna) a so skupinou kontrolných vzoriek, ktoré boli HPV negatívne, v minulosti nepodstúpili operáciu krčka maternice a mali normálny výsledok cytológie. Výsledky analýzy mRNA boli porovnané s imunohistochemickým farbením p16 proteínu na tkanivových blokoch získaných pri operačnej liečbe (konizácia, hysterektómia) tých pacientok, u ktorých boli vykonané OC stery.

Štatistická analýza

Pri štatistickej analýze bola využitá metóda imunohistochemického farbenia ako zlatý štandard kontroly pozitivity nového (RQ) testu. Výsledok relatívnej kvantifikácie bol hodnotený ako pozitívny pri cut-off hodnote RQ≥1,58 na základe analýzy ROC krivky. Na štatistické spracovanie a vyhodnotenie dát bol použitý softvér StatsDirect, verzia 2.7.8 (StatsDirect Ltd, UK). Pre zistenú optimálnu cut-off hodnotu bola následne vypočítaná senzitivita, špecificita, pozitívna a negatívna prediktívna hodnota a pomer vierohodností (likelihood ratio) pozitívneho a negatívneho výsledku testu. Výsledky sú uvádzané spolu s odpovedajúcim intervalmi spoľahlivosti (confidence interval, CI). Vzájomná korelácia diagnostickej presnosti ddCt metódy cervikálnych sterov v porovnaní s presnosťou IHC vyšetrenia v bioptizovaných vzorkách bola vykonaná pomocou Pearsonovho korelačného koeficientu. Za štatisticky významnú bola považovaná hodnota p<0,05.

VÝSLEDKY

Analýza DNA

V kontrolnom súbore (n=45) sme zistili prítomnosť papilomavírusov u 33% vzoriek a sekvenačnou analýzou boli najčastejšie určené vysokorizikové subtypy HPV 16, 18 a nízkorizikový HPV 61. V súbore pacientok s léziou krčka maternice bolo najviac pacientok HPV 16 pozitívnych (53,3 %), ďalšie detegované vysokorizikové subtypy boli HPV 18, 52 a 33 a potenciálne karcinogénny HPV 66. Pozitivita na vysokorizikové, resp. potenciálne karcinogénny HPV 66 bola u 64,5 % vzoriek. Infekcia nízkorizikovými subtypmi HPV 32, 70 bola u 4,4 % vzoriek. Pomerne častý bol výskyt dvojitej infekcie HPV 16 s HPV 18, pričom spoločne s týmito HPV sa nachádzali aj pridružené infekcie inými papilomavírusmi, u 13,3 % (tab. 2). Celkovo bola v kontrolnom súbore a v súbore pacientok s léziou krčka maternice HR-HPV pozitivita u 44,4 % vzoriek, dvojité infekcie s vysokorizikovými aj nízkorizikovými papilomavírusmi boli u 8,9 % pacientok a u 4,4 % pacientok sa nachádzala infekcia nízkorizikovými subtypmi.

**Table 2. Zastúpenie HPV genotypov v sledovaných skupinách pacientok**

Analýza RNA

Z kontrolného súboru boli vylúčené HPV pozitívne vzorky, vzorky s nedostatkom RNA a prebiehajúcim zápalom, čo bolo potvrdené z histologického vyšetrenia, prípadne vzorky s výrazne zvýšenou expresiou p16^INK4A mRNA transkriptu (relatívna kvantita – RQ>3). Z HPV pozitívneho súboru bolo 8 vzoriek vylúčených kvôli výraznému zápalu potvrdenému z histológie a nedostatku RNA. Pomocou real time PCR sme zvolili v softvéri metódu relatívnej kvantifikácie (komparatívna ddCt), ktorá umožnila určiť relatívne množstvo p16^INK4A mRNA transkriptu oproti mRNA housekeeping génu – ACTB a kontrolnej skupine [17]. Amplifikácia ACTB aj p16^INK4A transkriptu prebehla so 100% efektivitou. Zistili sme mierne zníženú expresiu p16^INK4A transkriptu v L-SIL skupine (n=10) oproti kontrolným vzorkám, štvornásobne zvýšenú u H-SIL (n=20) a desaťnásobne zvýšenú u karcinómov (SCA, n=7). Expresia p16^INK4A v CaSki bunkovej línii (HPV 16 pozitívna) bola 74-násobne zvýšená. V HeLa bunkovej línii (HPV 18 pozitívna) hladina p16^INK4A dosahovala zhruba expresnú hladinu skupiny karcinómov (graf 1).

Graph 1. Výsledky expresie p16<sup>ink4a</sup> mRNA transkriptu v skupinách pacientok s rôznou závažnosťou cervikálnej lézie. Metóda relatívnej kvantifikácie určila hladinu expresie p16 mRNA transkriptu v kontrolnej skupine ako RQ=1 (ddCt=0). Ostatné skupiny vzoriek sú porovnané k tejto hodnote, pričom čísla nad stĺpcami grafu udávajú, koľkonásobne je expresia p16<sup>ink4a</sup> zvýšená resp. znížená

Výsledky získané metódou RQ sme na základe „cut-off“ hodnoty (RQ≥1,58) vyhodnotili ako pozitívne. Nadexpresia p16^INK4A bola zistená u 30 % L-SIL (3/10), 75 % vzoriek skupiny H-SIL (15/20) a 85,7 % vzoriek SCA (6/7). Imunohistochémiou bolo vyhodnotených 30 % vzoriek pozitívnych v L-SIL skupine (3/10), 90 % v H-SIL (18/20) a 85,7 % v SCA (6/7). Počty vzoriek, ktoré boli vyhodnotené obomi metódami ako pozitívne uvádza tab. 3.

Table 3. Počty vzoriek v skupinách, ktoré boli vyhodnotené ako pozitívne metódami imunohistochémie (IHC) a relatívnou kvantifikáciou (RQ) na základe „cut-off“ hodnoty 1,58. Pearsonov korelačný koeficient (r=0,9897; p=0,0913)

Štatistická analýza diagnostickej validity testu (RQ metódy)

Plocha pod ROC krivkou AUC = 0,71 (95% CI: 0,51–0,92), (graf 2). Senzitivita vyšetrenia mRNA transkriptov p16^INK4A v cervikálnom stere pomocou relatívnej kvantifikácie pri „cut-off“ hodnote 1,58 bola 81,48 % (95% CI: 61,92–93,7%) a špecificita 60 % (95% CI: 26,24–87,84%). Pozitívna prediktívna hodnota bola 84,62 % (95% CI: 65,13–95,64 %), negatívna prediktívna hodnota 54,55 % (95% CI: 23,38–83,25 %). Koeficient pravdepodobnosti (Likelihood Ratio) v prípade pozitívneho testu bol 2,04 (95% CI: 1,12–4,91) a v prípade negatívneho testu bol 0,31 (95% CI: 0,12–0,79). Vzájomné porovnanie diagnostickej presnosti určovania pozitivity p16^INK4A medzi ddCt metódou v OC steroch v porovnaní s IHC v bioptizovanom materiále preukázala 66,7% zhodu pre diagnostiku prítomnej pozitivity p16 v L-SIL léziách, 59,5% zhodu v H-SIL léziách a 100% konkordanciu pre SCA (r = 0.9897, p<0,0913).

Graph 2. ROC krivka pre RQ metódu. Optimálna „cut-off“ hodnota bola určená na základe maximalizácie hodnoty (senzitivita + špecificita). Zistená hodnota bola RQ=1,58. Zistená hodnota plochy pod ROC krivkou = 0,71; 95% CI = 0,51–0,92

DISKUSIA

Karcinóm krčka maternice spôsobuje infekcia ľudskými papilomavírusmi, ale na karcinogenéze sa podieľajú rôzne HPV subtypy zo skupiny vysokorizikových papilomavírusov (HR-HPV). Podobne ako sa uvádza v celosvetových prácach, aj nám sa podarilo dokázať, že najväčšiu prevalenciu a podiel na vzniku dysplázií krčka maternice mali vírusové subtypy HPV16 a HPV18. Bolo potvrdené, že u žien s prvým HPV16 pozitívnym výsledkom sa extrémne zvyšuje riziko rozvoja CIN 3 alebo karcinómu krčka maternice v priebehu 10 rokov na rozdiel od infekcie inými HPV subtypmi [9]. Hoci je HPV16 najrozšírenejší v populácii, predsa len infekcia s HPV18 a HPV45 môže niesť väčšie riziko pri rozvoji karcinómu, resp. adenokarcinómu [3].

HPV typovo špecifická prevalencia zahŕňa infekcie jedným alebo viacerými vírusovými subtypmi. Pri infekcii viacerými vírusovými subtypmi nie je presne známe, v akom rozsahu jeden vírusový subtyp existuje v prítomnosti druhého [1]. Podobne sme zaznamenali aj my prítomnosť koinfekcie HPV16 s HPV18 a ďalšími HPV subtypmi. V poslednom čase sa venuje zvýšená pozornosť práve koinfekciám, pretože i napriek prvotným limitáciám [23] začína byť čoraz viac dostupná vakcinácia proti HPV infekcii a následne sa môže jej zavedením do bežnej praxe modifikovať vyváženosť distribúcie papilomavírusov v rámci populácie [10].

Expresia p16^INK4A proteínu je úzko spojená s onkogénnou aktivitou v bunkách krčka maternice a nezávisí od toho, ktorý HPV subtyp je v bunkách prítomný [2]. p16^INK4A je v normálnych bunkách krčka maternice exprimovaný v nízkej hladine, kým v dysplastických bunkách je v silnej nadexpresii a dá sa jednoducho odhaliť imunohistochémiou. Z tohto dôvodu môže byť p16^INK4A proteín považovaný za náhradný marker pre aktivovanú onkogénnu expresiu vysokorizikových papilomavírusov v dysplastických bunkách krčka maternice [11]. V minulosti boli robené viaceré štúdie zameriavajúce sa na prítomnosť vysokorizikových papilomavírusov a stupeň imunohistochemického zafarbenia postoperačných preparátov, prípadne sterov z krčka maternice odobratých do tekutého média. V niektorých prácach je významný pomer medzi závažnosťou lézie H-SIL/SCA a p16 pozitivitou (100 %), avšak p16 pozitivita menej koreluje s L-SIL (46,2 %), [15]. V podobnej prehľadovej štúdii bola tiež zistená až 100% p16 pozitivita u H-SIL a 80% pozitivita u L-SIL sterov, pričom bola rozdielna intenzita zafarbenia preparátov. Z týchto prípadov 35 % H-SIL a 26,6 % L-SIL prípadov bolo HR-HPV pozitívnych a všetky HPV pozitívne preparáty boli pozitívne aj na p16 proteín. Títo autori však nezistili štatisticky významný vzťah medzi HPV infekciou a intenzitou a distribúciou p16 proteínu v dysplastických bunkách [22]. V našej štúdii sme zistili 30 % pozitívnych vzoriek na p16^INK4A mRNA transkript u L-SIL, 75 % pozitívnych vzoriek v H-SIL a 85,7 % vzoriek pozitívnych na p16 u SCA. HPV vírus bol prítomný u 60 % L-SIL, 70 % H-SIL a 100 % SCA. Tiež sme zistili, že nie vždy bola HPV infekcia spojená so signifikantne zvýšenou expresiou p16^INK4A transkriptu v steroch krčka maternice. Tento fakt pripisujeme imunitnej modulácii karcinogénnej aktivity HPV infekcie umožňujúcej podobne ako pri iných nádoroch [5], spontánnu regresiu neoplázie [12, 14]. Expresia p16^INK4A transkriptu bola v L-SIL skupine mierne znížená, čo by mohlo byť spôsobené hypermetyláciou p16 promótorovej oblasti a tým by dochádzalo k zníženej expresii p16 proteínu oproti kontrolnej skupine, aj keď táto hypermetylácia nemá vzájomný vzťah s HPV infekciou alebo závažnosťou SIL [8].

Štatistickou analýzou výsledkov získaných metódou RQ sme ohodnotili diskriminačnú schopnosť tejto diagnostickej metódy. IHC bola dlhodobo uvažovaná za zlatý štandard v diagnostike lézií krčka maternice. Zistené hodnoty AUC pod ROC krivku a následne aj hodnoty senzitivity, špecificity a ďalších ukazovateľov hovoria o vysokej diskriminačnej schopnosti nami analyzovaného testu, ktorá môže nahradiť biopsiu lézií porcia uteru. Aby však bola metóda použiteľná pre širokú klinickú prax, je potrebné spresniť odhady štatistických ukazovateľov diskriminačnej schopnosti testu (t.j. získať užšie 95% intervaly spoľahlivosti) cestou jej overovania na väčších súboroch pacientok. Výrazným benefitom tohto prístupu v diagnostike premalígnych lézií krčka maternice je aj to, že metódou relatívnej kvantifikácie sa dá určiť hladina expresie p16^INK4A mRNA transkriptu ešte pred operáciou lézie, čo umožňuje ako jeden z biomarkerov predpovedať biologické správanie sa a stupeň onkogénnej aktivity cervikálnych lézií.

ZÁVER

V našej štúdii sa nám podarilo zistiť prevalenciu papilomavírusových infekcií v steroch z lézií krčka maternice. Dokázali sme, že najčastejšie sa vyskytujú vírusové subtypy HPV 16 a 18. Taktiež sa nám podarilo zaviesť doplnkovú metódu na určenie hladiny expresie p16^INK4A mRNA transkriptu v steroch z krčka maternice ešte pred chirurgickým odstránením lézie. Metóda dosahuje takmer podobnú efektivitu ako imunohistochémia vykonávaná na postoperačných preparátoch. No na rozdiel od nej si nevyžaduje invazívny výkon (biopsiu), či „zbytočne diagnostickú“ negatívnu operáciu u pacientky, najmä v prípade zvažovania zachovania jej fertility.

Poďakovanie

Práca bola podporená grantmi UK/71/2010, UK/103/2011 a projektom „Molekulová diagnostika rakoviny krčka maternice“ (ITMS: 26220220113) spolufinancovaným zo zdrojov EU.

Mgr. Veronika Janušicová

Gynekologicko-pôrodnícka klinika JLF UK a UNM

Kollárova 2

036 59 Martin

Slovenská republika

e-mail: veronika.janusicova@jfmed.uniba.sk

Sources

1. Clifford, G., Franceschi, S., Diaz, M., et al. Chapter 3: HPV type-distribution in women with and without cervical neoplastic diseases. Vaccine, 2006, 24, Suppl 3, p. S26–S34.

2. Cuschieri, K., Wentzensen, N. Human papillomavirus mRNA and p16 detection as biomarkers for the improved diagnosis of cervical neoplasia. CEBP, 2008, 17, p. 2536–2545.

3. Cuzick, J., Mayrand, MH., Ronco, G., et al. Chapter 10: New dimensions in cervical cancer screening. Vaccine, 2006, 24, p. S90–S97.

4. Doorbar, J. The papillomavirus life cycle. J Clin Virol, 2005, 32, p. S7–S15.

5. Dussan, C., Zubor, P., Fernandez, M., et al. Spontaneous regression of a breast carcinoma: a case report. Gynecol Obstet Invest, 2008, 65, 3, p. 206–211.

6. Franekova, M., Zubor, P., Stanclova, A., et al. Association of p53 polymorphisms with breast cancer: a case-control study in Slovak population. Neoplasma, 2007, 54, 2, p. 155–161.

7. Gravitt, PE., Peyton, CL., Alessi, TQ., et al. Improved amplification of genital human papillomaviruses. J Clin Microbiol, 2000, 38, p. 357–361.

8. Kang, S., Kim, J., Kim, HB., et al. Methylation of p16ink4a is a non-rare event in cervical intraepithelial neoplasia. Diagn Mol Pathol, 2006, 15, 2, p. 74–82.

9. Khan, MJ., Castle, PE., Lorincz, AT., et al. The elevated 10-year risk of cervical precancer and cancer in women with human papillomavirus (HPV) type 16 or 18 and the possible utility of type-specific HPV testing in clinical practice. J Natl Cancer Inst, 2005, 97, 14, p. 1072–1079.

10. Liaw, KL., Hildesheim, A., Burk, RD., et al. A prospective study of human papillomavirus (HPV) type 16 DNA detection by polymerase chain reaction and its association with acquisition and persistence of other HPV types. J Inf Dis, 2001, 183, p. 8–15.

11. Murphy, N., Ring, M., Killalea, AG., et al. p16INK4A as a marker for cervical dyskaryosis: CIN and cGIN in cervical biopsies and ThinPrep smears. J Clin Pathol, 2003, 56, p. 56–63.

12. Negri, G., Bellisano, G., Zannoni, GF., et al. p16 ink4a and HPV L1 immunohistochemistry is helpful for estimating the behavior of low-grade dysplastic lesions of the cervix uteri. Am J Surg Pathol, 2008, 32, 11, p. 1715–1720.

13. Ondrusova, M., Zubor, P., Ondrus, D. Time trends in cervical cancer epidemiology in the Slovak Republic: reflection on the non-implementation of screening with international comparisons. Neoplasma. 2012, 59, 2, p. 121–128.

14. Įvestad, IT., Gudlaugsson, E., Skaland, I., et al. Local immune response in the microenvironment of CIN2-3 with and without spontaneous regression. Mod Pathol, 2010, 23, 9, p. 1231–1240.

15. Ozgul, N., Cil, AP., Bozdayi, G., et al. Staining characteristics of p16INK4a: Is there a correlation with lesion grade or high-risk human papilloma virus positivity? J Obst Gyn Res, 2008, 34, 5, p. 865–871.

16. Paavonen, J. Human papillomavirus infection and the development of cervical cancer and related genital neoplasias. Int J Inf Dis, 2007, 11, Suppl 2, p. S3–S9.

17. Pfaffl, MW. A new mathematical model for relative quantification real time PCR. Nucleic Acids Res, 2001, 29, 9, p. 2002–2007.

18. Scheurer, ME., Tortolero-Luna, G., Adler-Storthz, K. Human papillomavirus infection: biology, epidemiology, and prevention. Int J Gyn Cancer, 2005, 15, 5, p. 727–746.

19. Steinau, M., Rajeevan, MS., Unger, ER. DNA and RNA references for qRT-PCR assays in exfoliated cervical cells. J Mol Diagn. 2006, 8, 1, p. 113–118.

20. Weaver, BA. Epidemiology nad natural history of genital human papillomavirus infection. JAOA, 2006, 106, 3, Sup. 1, p. S2–S7.

21. World Health Organization: Comprehensive cervical cancer control: a guide to essential practice [on-line]. Geneva, Switzerland, WHO. [cit. 2006-06-24] Dostupný z WWW: <http://www.who.int/reproductive-health/publications/cervical_cancer_gep/index.htm>.

22. Yildiz, IZ., Usubutun, A., Firat, P., et al. Efficiency of immunohistochemical p16 expression and HPV typing in cervical squamous intraepithelial lesion grading and review of the p16 literature. Pathol Res Pract, 2007, 203, p. 445–449.

23. Zubor, P., Danko, J., Kajo, K., Szunyogh, N. Low affordability may limit the effect of cervical cancer vaccination in central and eastern European countries. J Clin Oncol, 2007, 25, 34, p. 5534–5537.