Porovnání exprese imunohistochemických markerů ve vzorcích z hysteroskopie a hysterektomie u pacientek s karcinomem endometria

Overview

Cíl studie:
Zjistit pomocí imunohistochemického vyšetření expresi p53, bcl-2, c-erbB-2, Ki-67, estrogenového (ER) a progesteronového receptoru (PR), MMP-7, MMP-26 ve vzorcích z diagnostické hysteroskopie a následné hysterektomie u pacientek s karcinomem endometria.

Typ studie:
Experimentální prospektivní studie.

Název a sídlo pracoviště:
Porodnicko-gynekologická klinika, Ústav lékařské genetiky, Ústav patologie LF UP a FN Olomouc.

Metodika:
Studovali jsme 43 případů primárně neléčeného karcinomu endometria, u nichž jsme vyhodnocovali grade a expresi imunomarkerů pomocí histoskóre v materiálu získaném z hysteroskopie a následné hysterektomie.

Výsledky:
Do skupiny grading G1 bylo na základě hysteroskopie zařazeno 31 (72,1 %), do G2 to bylo 7 (16,3 %) a do G3 5 (11,6 %) pacientek. V grade 1 byla míra shody v 77,4 % případů, v grade 2 to bylo ve 14,3 % případů a v grade 3 byla míra shody v 80,0 % případů.

V materiálu z diagnostické hysteroskopie jsme zjistili u p53 expresi ve 23 případech (53,5 %), u bcl-2 v 37 (86,0 %), u c-erbB-2 ve 20 (46,5 %), u Ki-67 ve 29 (67,4 %), u ER ve 37 (86,0 %), u PR v 36 (83,7 %), u MMP-7 ve 25 (58,1 %) a u MMP-26 ve 23 případech (53,5 %).

Exprese jednotlivých imunomarkerů v materiálu z hysterektomie byla u p53 pozitivní ve 13 (30,2 %), u bcl-2 pozitivní v 33 (76,7 %), u c-erbB-2 pozitivní ve 24 (55,8 %), u Ki-67 pozitivní ve 25 (58,1 %), u ER pozitivní ve 36 (83,7 %), u PR pozitivní ve 40 (93,0 %), u MMP-7 pozitivní ve 27 (62,8 %) a u MMP-26 pozitivní ve 23 (53,5 %) z celkem 43 případů.

Závěr:
Výsledky naší práce potvrzující shodu v expresi p53, bcl-2, PR a MMP-7 v materiálu z diagnostické hysteroskopie a následné hysterektomie u pacientek s karcinomem endometria, která by mohla být využita pro terapeutický algoritmus u karcinomu endometria.

Klíčová slova:
karcinom endometria, imunohistochemie, prognostické faktory, hysteroskopie.

ÚVOD

Endometriální karcinom je v současné době nejčastěji se vyskytujícím pánevním maligním onemocněním u žen [33]. Vzhledem k tomu, že až v 90 % případů je prvním příznakem děložní krvácení, je časná detekce tohoto onemocnění pomocí kyretáže nebo hysteroskopie s cílenou biopsií relativně snadná a jen malá část případů zůstává asymptomatických [3]. Ve skutečnosti je v 75 % diagnostikováno v klinickém stadiu I [18]. Karcinom endometria je velmi dobře léčitelným onemocněním s 83% 5letým přežitím. Nicméně počet pacientek, které ročně zemřou v důsledku tohoto onemocnění, je velmi vysoký a převyšuje počet úmrtí u onemocnění karcinomem děložního hrdla [1].

Chirurgický staging je podle doporučení Mezinárodní federace gynekologie a porodnictví (FIGO) nejdůležitějším momentem při stanovování prognózy pacientek [46]. Revidovaný systém FIGO stagingu rozlišuje tři stupně histologické diferenciace: dobře diferencovaný adenokarcinom (G1), obsahující méně než 5 % ne-skvamózní ne-morulární solidní složky; středně diferencovaný adenokarcinom (G2), u něhož solidní část může tvořit 6–50% podíl; špatně diferencovaný adenokarcinom (G3) s více než 50 % solidní složky. Stupeň histologické diferenciace je nepochybně známkou specifické agresivity nádoru a jako takový je všeobecně považován za klíčový prognostický faktor. Literární údaje srovnávající stupeň histologické diferenciace v materiálu získaném při hysteroskopii nebo kyretáži a následné hysterektomii svědčí o značné neshodě [5, 7, 31, 34, 37, 41].

Nejen z tohoto důvodu, ale i pro určitou omezenou vypovídací schopnost dalších klinicko-patologických faktorů z hlediska prognózy onemocnění byla studována celá řada molekulárně biologických markerů. Abnormální zvýšená exprese p53 tumor supresorového genu u karcinomu endometria koreluje s agresivními histologickými typy, pokročilým stadiem onemocnění a kratší dobou přežití [13, 21, 30]. Bcl-2 je onkogen, který inhibuje apoptózu a prodlužuje přežití buňky. Zvýšená exprese je popisována u hyperplazie endometria, kdežto ztráta exprese je spojována s horší prognózou, větší hloubkou myometriální invaze, pokročilejším stupněm onemocnění a vyšší pravděpodobností výskytu lymfatických metastáz [9, 30, 38, 47].

Amplifikace a zvýšená exprese onkogenu c-erbB-2 (lidský celulární onkogen identický s krysím HER 2/neu) se vyskytuje u 10–40 % karcinomů endometria a koreluje s horší prognózou a agresivnějším chováním nádoru [25]. Klinické využití tohoto faktoru zůstává zatím nejednoznačné, protože negativní prognostický dopad nebyl potvrzen ve všech studiích [36].

Mezi jeden z nejznámějších markerů buněčné proliferace patří Ki-67. Korelace s gradingem, stadiem onemocnění a histopatologickým typem tumoru byla potvrzena v mnoha studiích [10, 39, 40].

Jak v epiteliálních, tak ve stromálních buňkách endometria jsou přítomné estrogenové (ER) a progesteronové (PR) receptory. Zdá se, že exprese ER a PR hraje významnou roli v endometriální kancerogenezi. Podle výsledků řady studií je exprese těchto receptorů spojena s dobře diferencovanými tumory, koreluje se stadiem nádoru a přežitím [14, 16, 27].

Matrix metaloproteináza (MMP-7) byla imunolokalizována v nádorových buňkách 73 % případů endometriálního karcinomu a vyšší hladina její exprese byla spojena s pokročilejším stupněm onemocnění a přítomností metastáz v lymfatických uzlinách [44].

Vysoké hladiny matrix metaloproteinázy 26 (MMP 26) byly popsány v hyperplastickém endometriu, zatímco s histologickou dediferenciací její exprese v endometriálním karcinomu klesá. Podobně jako MMP-7 je i tento enzym omezen pouze na epiteliální a nádorové buňky endometria [35].

Endometriální nádory jsou snadno diagnostikovatelné pomocí hysteroskopie nebo kyretáže. Přesnější identifikace vysoce rizikových pacientek před primární radikální chirurgií by umožnila individualizaci léčby, zpřesnění plánování chirurgického zákroku, umožnila by převést rizikové pacientky do specializovaných center a potenciálně snížit morbiditu extenzivní lymfadenektomie u nízce rizikových pacientek.

Cílem studie bylo porovnat výsledky vyhodnocení grade a imunohistochemickou expresi p53, bcl-2, c-erbB-2, Ki-67, ER, PR, MMP-7 a MMP-26 ve vzorcích endometriálních tumorů získaných z hysteroskopie nebo kyretáže a následné hysterektomie u identických pacientek.

SOUBOR PACIENTEK A METODIKA

Charakteristika souboru

V období od srpna 2005 do března 2009 jsme na Porodnicko-gynekologické klinice FN Olomouc studovali 43 případů primárně neléčeného karcinomu endometria. U všech pacientek byla provedena diagnostická hysteroskopie (HSK) s následnou abdominální či vaginální hysterektomií (HY) a oboustrannou adnexektomií. Systematická pánevní lymfadenektomie byla provedena u 32 (74,4 %) pacientek. Průměrný věk pacientek byl 64,0 let (rozmezí 34-88). Pooperační staging byl proveden podle FIGO klasifikace (1988). Do stadia I dle FIGO klasifikace bylo zařazeno 34 (79,0 %) pacientek, do stadia II 3 (7,0 %) pacientky a do stadia III a IV 6 (14,0 %) pacientek. Histologickým typem nádoru byl ve všech případech endometriální karcinom.

Imunohistochemické zpracování

Zpracovaný materiál tvořily vždy dva vzorky od každé pacientky. Jednalo se o karcinomy endometria získané od pacientek z abdominální hysterektomie po potvrzení diagnózy z předchozí diagnostické hysteroskopie. Vzorky byly standardně rutinně zpracovány po 24hodinové fixaci 10% formaldehydem a zality do parafinových bloků s následným rutinním barvením hematoxylin-eosinem pro světelnou mikroskopii ke stanovení histopatologické diagnózy. Pro následnou sérii imunohistologických vyšetření byly vybrány vzorky s dostatečným množstvím dobře zachované nádorové struktury a zpracovány ve tkáňových řezech o síle 5 až 8 μm na sklíčkách potažených Vectabondem (Vector). Pro detekci jednotlivých markerů byla použita standardní nepřímá imunohistochemická technika se souborem králičích nebo myších protilátek (pro p53, c-erbB-2, Ki-67, ER a PR – DAKO, pro bcl-2 – BIOGENEX, pro MMP 7 a MMP-26 ABCAM).Vyšetření byla prováděna s pozitivní kontrolou.

Kvantifikace pozitivity byla vyjadřována v procentech. Jako hranice pozitivity p53, bcl-2, c-erbB-2, Ki-67, MMP-7 a MMP-26 byla stanovena hodnota mediánu. Jako p53 a bcl-2 pozitivní byly hodnoceny vzorky s jaderným barvením 20 % nádorových buněk a více, jako Ki-67 pozitivní s barvením 40 % a více. Vzorky s membránovou pozitivitou c-erbB-2 byly hodnoceny jako pozitivní v 10 % a více, hranice pozitivity MMP-7 byla stanovena na 65 % a více, MMP-26 40 % a více. Hranice pozitivity ER a PR byla na základě četných předchozích studií stanovena na 5 %.

Statistické vyhodnocení

K posouzení vztahu grade a imunohistochemických markerů ze vzorků z hysteroskopie a z hysterektomie byly použity χ² test a Fisherův exaktní test. Hladina statistické významnosti byla stanovena pro p<0,05. Ke zpracování byl použit statistický program SPSS verze 15 (SPSS Inc., Chicago, USA).

VÝSLEDKY

Do skupiny grading (G) 1 bylo na základě hysteroskopie zařazeno 31 (72,1 %), do G2 7 (16,3 %) a do G3 5 (11,6 %) pacientek. Skupinu G1 na základě definitivního histopatologického vyšetření materiálu z hysterektomie tvořilo 29 (67,4 %), skupinu G2 2 (4,7 %) a skupinu G3 12 (27,9 %) pacientek resp. (tab. 1).

K podhodnocení grade došlo u 5 pacientek (11,6 %), u 4 pacientek byl z kyretáže stanoven grade 1 a po hysterektomii byl určen grade 2, u jedné pacientky s grade 1 byl po hysterektomii určen grade 3.

K nadhodnocení grade došlo u 9 pacientek (20,9 %), u jedné pacienky s grade 2 po kyretáži byl po hysterektomii stanoven grade 1, u 6 pacientek s grade 3 byl po hysterektomii stanoven grade 1 a u 2 pacientek grade 2.

V grade 1 byla míra shody v 77,4 % případů, v grade 2 to bylo ve 14,3 % případů a v grade 3 byla míra shody v 80,0 % případů (tab. 2).

Celková přesnost při stanovení grade z hysteroskopie byla 67,4 % (29 z 43), 95% CI: 51,5–80,9 %. (tj. 95% interval spolehlivosti pro přesnost).

V materiálu z diagnostické hysteroskopie jsme zjistili u p53 expresi ve 23 (53,5 %), u bcl-2 v 37 (86,0 %), u c-erbB-2 ve 20 (46,5 %), u Ki-67 ve 29 (67,4 %), u ER ve 37 (86,0 %), u PR v 36 (83,7 %), u MMP-7 ve 25 (58,1 %) a u MMP-26 ve 23 (53,5 %) případů.

Exprese jednotlivých imunomarkerů v materiálu z hysterektomie byla u p53 pozitivní ve 13 případech (30,2 %), u bcl-2 byla pozitivní v 33 (76,7 %), u c erbB 2 pozitivní ve 24 (55,8 %), u Ki-67 pozitivní ve 25 (58,1 %), u ER pozitivní ve 36 (83,7 %), u PR pozitivní ve 40 (93,0 %), u MMP-7 pozitivní ve 27 (62,8 %) a u MMP-26 pozitivní ve 23 (53,5 %) z celkem 43 případů.

Přehled shody výsledků vyšetření imunomarkerů p53, bcl-2, c-erbB-2, Ki-67, ER, PR, MMP-7 a MMP-26 v materiálu z hysteroskopie a hysterektomie je uveden v tabulkách 3, 4 a 5.

U p53 negativní skupiny byla zjištěna signifikantně vyšší míra shody (75,0 %) ve srovnání s p53 pozitivní skupinou (34,8 %), p = 0,008 (χ² test).

Signifikantně vyšší míra shody byla prokázána u bcl 2 pozitivní skupiny (78,4 %) ve srovnání s bcl-2 negativní skupinou (33,3 %), p = 0,042.

Fisherův exaktní test prokázal signifikantně vyšší míru shody u skupiny s pozitivními P receptory (92,7 %) ve srovnání se skupinou s negativními PR (28,6 %), p = 0,0001.

U MMP-7 pozitivní skupiny (52 %) prokázal Fisherův exaktní test signifikantně vyšší míru shody ve srovnání s MMP-7 negativní skupinou (22,2 %), p = 0,049 (rozdíl je na hranici významnosti).

DISKUSE

Chirurgie zůstává stále základní metodou léčby endometriální karcinomu a obvykle sestává z hysterektomie a oboustranné adnexektomie. Sampling pánevních uzlin byl doporučen u žen s invazí přesahující 50 % tloušťky myometria, infiltrací cervikálního stromatu, mimoděložním šířením, nepříznivým histopatologickým typem (serózně papilární, karcinom z jasných buněk) a nízkou diferenciací tumoru [2, 4]. Vzhledem k tomu, že postižení lymfatických uzlin ve stadiu I endometriálního karcinomu je udáváno až v 11 %, doporučují někteří autoři provádět pánevní lymfadenektomii systematicky u všech pacientek, zejména s ohledem na zlepšení prognózování a individualizaci léčby [6, 12, 17, 24, 43]. Žádná ze studií však dosud neprokázala jednoznačný přínos lymfadenektomie, z hlediska přežití je tedy její benefit nejistý.

Předoperační identifikace vysoce rizikových pacientek s karcinomem endometria není v současné době optimální. Ačkoliv klinický staging koreluje velmi dobře s přežitím, je nepřesný z pohledu identifikace metastatického šíření až u jedné třetiny pacientek [22]. Věk pacientek, FIGO stadium, histologický typ a grade prokazatelně ovlivňují přežití, ale prognostický význam histologického typu nádoru, grade a postižení cervikálního stromatu získané na základě hysteroskopie nebo kyretáže je velmi omezený [2]. Špatně diferencované tumory jsou u hysteroskopií nebo kyretáží chybně diagnostikovány v 10 až 26 % a agresivní histologické typy nejsou rozpoznány v 36 až 54% případů [19, 20].

Identifikace spolehlivých markerů v materiálu z diagnostické operace, které by umožnily predikovat mimoděložní šíření onemocnění a prognózu, by výrazně usnadnilo terapeutické rozhodování.

Naše studie potvrdila diskrepance mezi grade nádoru endometria získaného z hysteroskopie a následné hysterektomie. Podobně jako v již publikovaných pracích jsme potvrdili vyšší shodu u grade 3 než u grade 1. Neprokázali jsme však postupně rostoucí trend shody od grade 1 ke grade 3, což je možné zřejmě vysvětlit malým počtem pacientek v grade 2. Celková přesnost hysteroskopie ve výši 67,4 % odpovídala z hlediska stanovení grade diagnostickou operací publikovaným údajům [26, 28, 34, 45]. Důvodů pro diskrepanci ve stanovení grade u diagnostické a definitivní operace může být několik. Mezi jinými může rozhodovat velikost vzorku, zkušenost chirurga, časování abnormního krvácení a výběr patologa.

Imunomarker p53 byl v našem materiálu z hysteroskopie exprimován ve 23 případech (53,5 %), což se blíží výsledku publikovanému Silvermanem et al., ale převyšuje výrazně výsledky dalších tří publikovaných studií [8, 23, 32, 42]. Silná korelace mezi expresí p53 v materiálu z diagnostického a terapeutického zákroku odpovídá údajům publikovaným v literatuře [8, 32].

Relativně vysoké hladiny exprese dosáhl v našem materiálu z hysteroskopie i antiapoptotický protein bcl-2, u kterého jsme současně zaznamenali i vysokou míru shody exprese s materiálem z hysterektomie. V literatuře provedli podobnou analýzu pouze Wang et al., kteří na menším souboru podobnou shodu nenalezli [45].

Pro onkogen c-erbB-2 jsme shodu exprese mezi hysteroskopií a hysterektomií nezjistili. V dostupné literatuře jsme podobné údaje nenalezli.

Velmi těsnou korelaci v expresi Ki-67 v diagnostickém a terapeutickém materiálu reportují Oreskovic et al. Je to v rozporu s našimi výsledky, kde stejně jako pro ER konkordanci nenalézáme. Naopak, velmi těsnou shodu v expresi PR potvrzují jak naše výsledky, tak výsledky Oreskovice et al. [32]. To je však v protikladu s údaji prezentovanými Wangem et al. [45].

Porovnání exprese matrix metaloproteináz MMP-7 a MMP-26 v materiálu z hysteroskopie a následné hysterektomie pro karcinom endometria dosud nebylo publikováno. Námi prokázaná shoda v expresi MMP-7 v tomto materiálu je tak prioritní.

ZÁVĚR

Výsledky naší práce potvrzující shodu v expresi p53, bcl-2, PR a MMP-7 v materiálu z diagnostické hysteroskopie a následné hysterektomie u pacientek s karcinomem endometria. Tato vysoká míra korelace naznačuje možnost klinického využití imunohistochemické analýzy materiálu z diagnostické operace u karcinomu endometria při rozhodování o dalším terapeutickém postupu. Dalším krokem by mělo být stanovení kritických hranic jednotlivých biomarkerů před jejich eventuálním zařazením do diagnosticko terapeutického algoritmu.

Tato studie byla podpořena grantem IGA MZ ČR NR 9098-4/2006.

Doc. MUDr. Radovan Pilka, Ph.D.
Gynekologicko-porodnická klinika
FN a LF UP
I. P. Pavlova 6
775 20 Olomouc