Cytotoxicita keramických materiálů

Práce se zabývá testováním cytototoxicity in vitro vybraných vzorků dentálních celokeramických materiálů. Materiály byly podrobeny testu přímého kontaktu a testu extraktu. Testy byly prováděny na populaci buněčné linie myších fibroblastů NIH 3T3 v buněčné kultuře. Z výsledků je patrné, že všechny materiály mohou být považovány za netoxické kromě lithium disilikátové keramiky.

Klíčová slova:
cytotoxicita, keramické dentální materiály

ÚVOD

Keramické materiály jsou v současné době považovány ve stomatologii za materiál první volby pro kvalitní protetické fixní rekonstrukce chrupu. Nejenže mají dokonalé estetické vlastnosti, ale i jejich vlastnosti mechanické jsou nyní srovnatelné s kovokeramickými náhradami [8, 10]. Mezi jejich další výhody patří i biologická netečnost keramiky. Na rozdíl od kovových náhrad neuvolňují v prostředí ústní dutiny ionty kovů, které mohou pak cytototoxicky [14] nebo alergogenně působit na okolní tkáně. Keramické materiály můžeme rozdělit podle chemického složení nebo podle technologie výroby [15]. Klasifikace keramiky podle chemického složení je pro zhodnocení vlastností materiálu vhodnější. V současné době keramiku dělíme na křemičitou skelnou, oxidovou sklem infiltrovanou a oxidovou či polykrystalickou [7]. Keramika křemičitá vyniká estetickými vlastnostmi, ovšem její vlastnosti mechanické poněkud zaostávají za  keramikou oxidovou. Keramika oxidová je dnes v popředí zájmu, zvláště keramika obsahující oxid zirkoničitý. Ten lze stabilizovat přidáním oxidů: CaO, MgO, Y₂O₃  nebo CeO₂. Vzniká slitina, která má tetragonální strukturu i při pokojové teplotě [3, 11]. Tento materiál dobře odolává ohybu a málo mění své vlastnosti vlivem stárnutí [4, 12]. Nejvíce je dnes používán oxid zirkoničitý v podobě 3Y-TZP (yttrium cation-doped tetragonal zirconia polycrystals) s obsahem 3 mol % Y₂O₃, který slouží jako stabilizátor (např. Cercon^®, Noritake atd.) [6] (obr. 1).

TOXICKÉ A CYTOTOXICKÉ ÚČINKY

Přestože je keramika považována za bioinertní materiál, je však nutné podotknout, že i mezi keramickými materiály existují rozdíly v jejich cytotoxickém působení na buňky gingivy a jiných tkání. Rozdílná cytotoxicita je podmíněná rozdílným chemickým složením jednotlivých materiálů.

Podle Bracketta a kol. [1] není možné považovat lithium disilikátovou keramiku za biologicky inertní. Stejný poznatek uvádějí též Messer a kol. [9]. Dle nich lithium disilikátová keramika, konkrétně Empres II, má horší biologické vlastnosti než většina dentálních slitin a kompozitních materiálů. Ovšem většina keramických materiálů je z hlediska cytotoxicity akceptovatelná stejně dobře jako dentální slitiny nebo kompozitní materiály. Uo a kol. [13] ve své práci publikovali cytotoxické působení některých 3Y-TZP materiálů (oxid zirkoničitý s obsahem 3 mol % Y₂O₃) na fibroblasty gingivy. Tyto materiály lze považovat za biologicky inertní.

Elshahawy a kol. [5] ve své práci uvádějí téměř nulové cytotoxické působení oxidové keramiky ve srovnání s vysoce ušlechtilými slitinami chromniklovými a slitinami obsahujícími ušlechtilou ocel. Covacci a kol. [2] vyloučili jakékoliv mutagenní a onkogenní účinky 3Y-TZP materiálů na fibroblasty. 

CÍL STUDIE

Naším cílem bylo ověřit, zda dochází k cytotoxickému působení námi vybraných keramických materiálů na buněčnou kulturu. 

MATERIÁL A METODIKA

Bylo vybráno jedenáct nejvíce používaných druhů keramických materiálů (tab. 1, tab. 2). Z každého druhu keramiky jsme vyrobili přesně definovaná jádra (10 kusů). Jednalo se o horní střední řezák, síla jádra byla 0,4 mm, hmotnost byla 0,22 g. Většina vzorků byla připravena CAD/CAM technologií, resp. technologií (MAD/MAM).

Zkouška sledovala cytotoxické působení pevného vzorku – jádra vybrané dentální keramiky na buněčnou linii myších fibroblastů NIH 3T3 v buněčné kultuře (European Collection of Cell Cultures (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SPG OJG United Kingdom (free from mycoplasma)). Testování cytotoxicity bylo založeno na aplikaci normy ČSN EN ISO 10993 část 5 (1999) – Biologické hodnocení prostředků zdravotnické techniky; dále pak dle ČSN EN ISO 7405 (1998) Stomatologie – Preklinické hodnocení biologické snášenlivosti prostředků zdravotnické techniky používaných ve stomatologii.

Pro zkoušení cytotoxicity in vitro byl sledován test přímého kontaktu a test extraktu. 

TEST PŘÍMÉHO KONTAKTU

Princip:

Zdravé buňky NIH 3T3 se v kultuře dělí, množí a adherují k vhodným kultivačním povrchům. Cytotoxická látka narušuje tyto procesy, což vede k poškození buněk, jejich odlučování z kultivačního povrchu a snížení jejich počtu v kultuře. Hodnocení cytotoxicity je při této metodě založeno na vizuálním – makroskopickém sledování inkorporace barviva krystalové violeti do živých buněk a mikroskopickém posouzení změn morfologie buněčné vrstvy (vakuolizace, odlučování buněk, cytolýza). Pokud se cytotoxický materiál uvede do kontaktu s buněčnou vrstvou, vytváří ve svém okolí zónu poškozených buněk, do které se barvivo neinkorporuje. Základem pro určení stupně cytotoxicity jsou šířka zóny – vzdálenost hranice nezbarvené zóny od okraje vzorku, popis změn stavu buněčné vrstvy a numerický odhad podílu poškozených buněk.

Pracovní postup:

Vzorky jsme před zahájením každého testu sterilizovali buď ponořením do 96% ethanolu, nebo v autoklávu po dobu 60 min. a analyzovali je v duplikátech. Test byl třikrát nezávisle opakován. Fibroblasty (7 ml suspenze, 10⁵ buněk/ ml), které byly naneseny na Petriho misky, poté jsme do středu misky umístili sterilizovaný vzorek tak, aby nedošlo k porušení buněčné vrstvy. Po 24 hodinách v inkubátoru jsme kulturu hodnotili pomocí inverzního mikroskopu. Poté jsme vzorky kultury obarvili a změny jsme sledovali opět v inverzním mikroskopu. Pozorování jsme současně vyfotografovali.

Hodnocení:

1. Plochu misky jsme dle šablony rozdělili na čtyři kvadranty.
2. Posuvným měřidlem bylo možné změřit vzdálenost hranice živých obarvených buněk od okraje testovaného vzorku.
3. S použitím inverzního mikroskopu při zvětšení 200x jsme posuzovali stav buněčné vrstvy (tab. 3).

Hodnocení stupně cytotoxicity:

Cytotoxicita vzorku je charakterizována poměrem Index zóny/Index lýzy (tab. 4).

TEST EXTRAKTU

Princip:

K přesnému zjištění množství živých buněk v kultuře se používá fotometrická metoda – MTT test. Tento test je založen na schopnosti živých buněk redukovat tetrazoliové soli na barevné formazanové produkty. Množství vytvořeného barviva, stanovené foto­metricky při vlnové délce 540 nm a vyjádřené absorbancí, je přímo úměrné metabolické aktivitě a počtu buněk v analyzovaném vzorku. Stupeň cytotoxicity je vyhodnocen na základě životnosti buněk, která je vyjadřována v % absorbance naměřené v kultuře v pří­tomnosti testované látky, vůči kontrolní kultuře bez daného vzorku.

Pracovní postup:

Vzorky jsme před zahájením každého testu sterilizovali buď ponořením do 96% ethanolu nebo v autoklávu po dobu 60 min. a analyzovali je opět v duplikátech. Extrakt jsme připravili v poměru 0,1 g vzorku na 1 ml extrakčního činidla. Extrakce probíhala za aseptických podmínek v kultivační láhvi v inkubátoru. Po ukončení extrakce byl extrakt pipetou přenesen do sterilní centrifugační zkumavky a centrigugován. Poté jsme testování cytotoxicity prováděli pro extrakt neředěný – 100% a při ředění 1:1 a 1:3. Test byl prováděn minimálně ve dvou nezávislých opakovacích cyklech.

Výpočet životnosti kultury:

Životnost kultury se stanovila výpočtem z průměru hodnot absorbance nalezených pro vzorek a pro kulturu buněk (kultura v nepřítomnosti vzorku):

Hodnocení stupně cytotoxicity ukazuje tabulka 5.

Výsledky:

Test přímého kontaktu byl ve všech případech negativní. Na obrázku 2 je zachycen mikroskopický obraz kultury fibroblastů při testování s keramickým materiálem LAVA™.

Životnost buněk v testu extraktu ukazují tabulky 6 a 7 a graf 1.

V případě  lithium disilikátové keramiky a v několika případech u oxidové keramiky infiltrované sklem (ZrO₂), klesla v testu extraktu životnost pod osmdesát procent.

V průběhu testování došlo u některých vzorků ke změně barvy.

DISKUSE

Výsledky ukazují, že všechny testované dentální materiály je možné považovat v testu přímého kontaktu za netoxické, s nulovým výsledkem cytotoxicity a Indexem zóny/ Indexu lýzy  0/0. V testu extraktu je stupeň cytotoxicity různý. Lithium disilikátová keramika IPS e. max^®  Press se jevila jako lehce toxická. Výsledky této studie jsou podpořeny i výsledky výzkumu zahraničních autorů [1, 9], z nichž plyne, že lithium disilikátovou keramiku není možné považovat za biologicky inertní. Cytotoxicita této keramiky byla dokonce větší než cytotoxicita chromniklových slitin testovaných v předchozí studii [14]. U dvou vzorků keramiky In-Ceram^® Zirconia byla životnost buněk nižší než 80 %. Při statistické analýze všech testovaných vzorků této keramiky je však životnost buněk celkově vyšší než 80 %.

U keramiky LAVA™, IPS e. max^® Press, In-Ceram^® Alumina, In-Ceram^® Zirconia a Cerec^® došlo při testování u všech vzorků ke změně odstínu testovaného jádra, přičemž nejvýraznější změna byla u keramiky In-Ceram^® Zirkonia (obr. 3, obr. 4, obr. 5).

Závěr

Všechny námi testované dentální materiály lze považovat za netoxické v testu přímého kontaktu. V testu extraktu se keramika lithium disilikátová - IPS e. max^® Press jevila jako lehce cytotoxická a za určitých podmínek i keramika In-Ceram^® Zirconia. V některých případech došlo při testu extraktu ke změně barvy jádra (vznik tmavšího odstínu), nejvíce u keramiky In-Ceram^® Zirconia.  

Studie byla podporována projektem GAUK č. 81508 a projektem IGA MZČR 9744-3.

MUDr. Lenka Vavřičková

Stomatologická klinika LF UK a FN

Sokolská 581

500 05  Hradec Králové

e-mail: vavrickova.l@seznam.cz