Obsahové látky
Philadelphus coronarius L.

Predložená práca sa zaoberá izoláciou a identifikáciou obsahových látok prítomných v listoch pajazmínu vencového – pustorylu věncového (Philadelphus coronarius L.). Metanolový extrakt sme roztrepávali do etylacetátu a vody. Z etylacetátového podielu sme izolovali dva flavonoidy: kempferol-3-O-rutinozid a kvercetín-3-O-rutinozid (rutín). Uvedené látky sme identifikovali pomocou spektrálnych metód, porovnaním výsledkov so štandardami a literatúrou.

Kľúčové slová:
Philadelphus coronarius – kempferol-3-O-rutinozid – kvercetín-3-O-rutinozid

Úvod

Philadelphus coronarius L. – pajazmín vencový z čeľade Hydrangeaceae je 2–3 m vysoký ker, ktorý sa u nás pestuje v parkoch a v záhradách ako obľúbená okrasná rastlina hlavne pre svoje intenzívne a príjemne voňajúce biele kvety. Obsahovým látkam tohto druhu a ich biologickým účinkom bolo doteraz venovaných už niekoľko prác. Po zistení cytotoxickej a antimikrobiálnej aktivity etanolového extraktu ^{1, 2)} sme začali študovať sekundárne metabolity, ktoré by sa mohli na danej aktivite podielať. V rode Philadelphus L. boli doteraz opísané hlavne látky polyfenolického charakteru ako flavonoidy a aromatické kyseliny ³⁾, ktorých obsah v nadzemných častiach rastliny bol stanovený kolorimetricky ⁴⁾. Z konárov tejto rastliny boli izolované triterpény taraxerol, amyrín, kyselina ursolová a oleanolová, ďalej kyselina kávová a protokatechová⁵⁾, z listov kumaríny umbeliferón a skopoletín, ďalej stigmasteryl-3β-D-glukozid, triterpény uvaol a 3β, 28β-dihydroxyoleán – 11(12), 13(18) – dién ⁶⁾, flavonoidové glykozidy apigenín-7-O-glukozid (kozmozid) a luteolín-7-O-glukozid (cynarozid) ⁷⁾.

Predložená práca opisuje izoláciu a identifikáciu obsahových látok z listov Philadelphus coronarius L. a prináša nové poznatky o výskyte flavonoidov v tejto časti rastliny.

POKUSNÁ ČASŤ

Materiál a metódy

Listy Philadelphus coronarius L. boli nazbierané v Arboréte Mlyňany v Ústave dendrobiológie Slovenskej akadémie vied a usušené pri laboratórnej teplote.

Na separáciu obsahových látok sme použili silikagél zn. Silpearl, pripravený podľa Pitru a Štěrbu ⁸⁾ a Sephadex LH-20 (Pharmacia, Uppsala, Švédsko). Na tenkovrstvovú chromatografiu bol použitý Silufol UV 254 a 366 nm (Kavalier, Votice). Detekcia chromatogramov sa robila ultrafialovým žiarením pri 254 a 366 nm po predchádzajúcom postriekaní chromatogramu Naturstoffreagenz A v metanole. Rozpúšťadlá použité pri chromatografii boli pred použitím predestilované.

Pri navažovaní sme používali analytické váhy Chyo JL-200 (Chyo, Japonsko). Teploty topenia sme merali na Koflerovom bloku (VEB Analytik Dresden, Nemecko) a nie sú korigované. Ultrafialové spektrá boli merané na prístroji Specord UV-VIS (Carl Zeiss, Jena, Nemecko) v metanole a po pridaní špecifických diagnostických skúmadiel podľa Mabryho ⁹⁾, infračervené spektrá na prístroji FT-IR Impact 400 D (Nicolet, Anglicko), hmotnostné spektra na prístroji HPLC Agilent 1100 Series s MS ion trap detektorom.

Extrakcia a izolácia látok

Zo 700 g usušených a pomletých listov Philadelphus coronarius L. sa v Soxhletových aparatúrach pripravili 4 extrakty: petroléterový, chloroformový, metanolový a butanolový. Metanolový extrakt sa vytrepal do etylacetátu a vody. Látky prítomné v etylacetátovom extrakte (15 g) sa delili na stĺpci silikagélu elúciou zmesou rozpúšťadiel chloroform : metanol : benzén v rôznom pomernom zastúpení. Eluáty sa zachytávali v množstvách priblížne po 100 ml. Tieto sa postupne odparovali a na základe výsledkov tenkovrstvovej chromatografie spojili do 17 frakcií hrubého delenia.

Rechromatografiou frakcie č. 15 a č. 16 sa získali dve mikrokryštalické látky.  

VÝSLEDKY A DISKUSIA 

Etanolový extrakt z listov Philadelphus coronarius L. sme delili roztrepávaním medzi vzájomne sa nemiešajúce rozpúšťadlá. Delenie etylacetátového podielu sme robili na kolóne silikagélu č. 3 v sústave chloroform : metanol : benzén.

Rechromatografiou frakcie č. 15 na Sephadexe LH-20 a po kryštalizácii z metanolu sme získali 7,3 mg svetložltých kryštálov s teplotou topenia 180–184 °C (I). Hmotnostné spektrum látky poskytlo v negatívnom móde molekulový ión [M-H⁺] o m/z 593 (glykozid) a fragment o m/z 285 (aglykón). V IČ spektre sú pásy hydroxylových skupín pri 1035 a 3370 cm^-1, pás pri 2915 cm^-1 typický pre metylénové skupiny, pás konjugovaného karbonylu pri 1650 cm^-1, pás pri 1070 cm^-1 typický pre vibrácie C-O sacharidovej zložky a pás pri 830 cm^-1 patriaci 1,2,3,5-tetrasubstituovanému benzénu. Utrafialové spektrum v metanole vykazuje pásy typické pre flavón: λ^MeOH_max nm: 268 a 350.

Po pridaní špecifických diagnostických skúmadiel sme namerali nasledujúce posuny maxím:

λ^NaOMe_max            nm: 277, 325, 405     Δ  I = + 55 nm

λ^AlCl_3max               nm: 277, 305, 354, 408            Δ  I = + 58 nm

λ^AlCl₃^/HCl_max          nm: 277, 305, 354, 408            Δ  I = + 58 nm

λ^NaOAc_max             nm: 277, 307, 386     Δ II = +   7 nm

λ^NaOAc/H₃^BO_3max    nm: 270, 310, 366     Δ  I = + 16 nm

Na základe výsledkov spektrálnej analýzy a tenkovrstvovej chromatografie na Silufole možno predpokladať, že látka (I) je glykozid kempferolu. To sme dokázali enzymatickou hydrolýzou (viď ďalší text).

Rechromatografiou frakcie č. 17 na Sephadexe LH-20 a po kryštalizácii z metanolu sme získali 8,1 mg svetložltých kryštálov s teplotou topenia 183–187 °C (II). Hmotnostné spektrum látky poskytlo v negatívnom móde molekulový ión [M-H⁺] o m/z 609 (glykozid) a fragment o m/z 301 (aglykón). V IČ spektre sú pásy hydroxylových skupín pri 1035 a 3415 cm^-1, pásy metylových a metylénových skupín pri 2920 a 2940 cm^-1, pás konjugovaného karbonylu pri 1660 cm^-1 a pás pri 1150 cm^-1 typický pre vibrácie C-O sacharidovej zložky.

Utrafialové spektrum v metanole vykazuje pásy typické pre flavón: λ^MeOH_max nm: 257, 265sh, 300sh a 349.

Po pridaní špecifických diagnostických skúmadiel sme namerali nasledujúce posuny maxím:

λ^NaOMe_max               nm: 270, 328, 412  Δ  I = + 54 nm

λ^AlCl_3max                  nm: 275, 305 sh, 433            Δ  I = + 75 nm

λ^AlCl₃^/HCl_max             nm: 275, 305 sh, 433            Δ  I = + 75 nm

λ^NaOAc_max                nm: 273, 307 sh, 392            Δ II = + 16 nm

λ^NaOAc/H₃^BO_3max       nm: 262, 286 sh, 379            Δ  I = + 21 nm

Na základe výsledkov spektrálnej analýzy a tenkovrstvovej chromatografie na Silufole možno predpokladať, že látka (II) je glykozid kvercetínu. To sme dokázali enzymatickou hydrolýzou.

Enzymatická hydrolýza látok I a II

Enzymatickú hydrolýzu sme uskutočnili β-glykozidázou (Sigma-Aldrich). Látku (I) sme rozpustili v zmesi metanol : voda = 1: 1 a po pridaní enzýmu nechali zmes inkubovať 15 hodín pri laboratórnej teplote. Po tomto čase sme roztok prefiltrovali a po odparení metanolu vytrepali s etylacetátom. Rovnakým spôsobom sme postupovali so vzorkou (II). Etylacetátové výtrepky látok (I a II) sme chromatograficky analyzovali spolu so štandardami kempferolom a kvercetínom na Silufole. Zistili sme, že látka (I) je po hydrolýze totožná s kempferolom a látka (II) je po hydrolýze zhodná s kvercetínom. Vo vodnom podieli hydrolyzátov sme dokázali chromatograficky na Lucefole prítomnosť glukózy a ramnózy.

Na základe porovnania UF spektier aglykónov s UF spektrami kempferolu a kvercetínu, porovnaním nameraných údajov s literatúrou ^{9, 10)} a so štandardami sme dokázali, že izolovaná látka (I) je kempferol-3-O-rutinozid a látka (II) je kvercetín-3-O-rutinozid (rutín).

Práca bola realizovaná s podporou grantovej úlohy č. 1/4289/07 VEGA MŠ SR.

Došlo 19. srpna 2010

Přijato 10. září 2010

Adresa pro korespondenci:

prof. RNDr. Daniel Grančai, CSc.

Katedra farmakognózie a botaniky FaF UK

Odbojárov 10, 832 32 Bratislava, Slovenská republika

e-mail: grancai@fpharm.uniba.sk