Látky ovlivňující aktivitu kaspas

Kaspasy jsou enzymy sehrávající klíčovou roli v programované buněčné smrti – apoptóze. Dysregulace tohoto procesu vede k řadě onemocnění, na jejichž patogenezi se podílí apoptóza. Nemoci lze rozdělit do dvou skupin: na onemocnění s patologickou inhibicí apoptózy (nádorová onemocnění, některé autoimunitní nemoci) a onemocnění s patologickou indukcí apoptózy (neurodegenerativní onemocnění, AIDS). Práce uvádí přehled nejdůležitějších zástupců aktivátorů a inhibitorů kaspas, které apoptózu řídí, a jsou proto v současnosti intenzivně studovány. Spektrofotometricky byl stanoven vliv skupiny derivátů stobadinu, theofylinu a adeninu na aktivitu kaspasy 1. Studované sloučeniny vykázaly inhibiční aktivitu vůči testovanému enzymu, která u jednoho z derivátů překročila 80 %.

Klíčová slova:
kaspasy – aktivace – inhibice – apoptóza – deriváty stobadinu, theofylinu, adeninu

Úvod

Buňka je základní funkční jednotkou každého živočišného či rostlinného organismu, splňuje jeho základní funkce, jako jsou růst, rozmnožování, metabolismus, pohyb a dědičnost. Normální buňka prodělává za fyziologických podmínek určité funkční i morfologické změny dané jejím genetickým programem. Pro správnou funkci organismu jako celku je důležitý nejen správný vznik a rozvoj buňky, ale i její včasný zánik. Zánik buňky může nastat nejenom jako konečný důsledek závažného poškození buňky, který se označuje jako nekróza, ale může být naprogramován se záměrem normální eliminace již nepotřebných buněk. V tomto případě mluvíme o apoptóze.

Apoptóza a nekróza se liší způsobem podmínek, za kterých probíhají, příčinami vzniku a množstvím postižených buněk ¹⁾. Nekróza probíhá za nepříznivých podmínek a dochází při ní k odumírání buněk většího rozsahu. Je způsobena náhodným poškozením buněk a navazující zánětlivou reakcí. V časné fázi nekrózy jsou narušeny buněčné membrány a buňky začnou „bobtnat“. Později dochází k rozpadu plazmatické a jaderné membrány a nastane únik vnitřního obsahu do okolí; tím se navodí zánětlivá reakce a nakonec rozpad postižené buňky ^2–5). Apoptóza probíhá za fyziologických podmínek jako programovaný zánik buněk během embryogeneze, hormon dependentní involuce u dospělých ³⁾. Sehrává centrální roli ve vývoji a v homeostáze živočichů a rostlin a je podkladem řady fyziologických i patologických mechanismů. Slovo apoptóza pochází z řečtiny: apo = od, ptein = padat. Je geneticky řízeným procesem, který je regulován vnějšími a vnitřními faktory. Pro buňku podléhající apoptóze jsou charakteristické morfologické a biochemické rysy, například ztráta asymetrie buněčné membrány, kondenzace chromatinu, zmenšení jádra, štěpení DNA, svrašťování buňky a nakonec její rozpad na apoptotická tělíska, která jsou pohlcena příslušnými buňkami bez vzniku zánětlivé reakce ^{3, 5–8)} (tab. 1).

Mechanismus apoptózy

Proces apoptózy nastává proteolýzou pro buňku životně důležitých intracelulárních bílkovin. Enzymy, které tuto proteolýzu katalyzují (nebo aktivují jiné efektorové molekuly), se nazývají kaspasy. K aktivaci kaspas vedou dvě cesty. První, vnější, nastává po navázání ligandu na membránový „receptor smrti“ s následnou indukcí „buněčnou smrt navozujícího signalizačního komplexu“. Ten dává vzniknout aktivním kaspasam 8 a 10, které pak aktivují efektorové prokaspasy 3, 6, 7. Druhá, vnitřní cesta apoptózy, je způsobena poškozením vnější mitochondriální membrány, s následným uvolněním mitochondriálních proteinů. Jedním z nich je cytochrom c, který v cytosolu spouští tvorbu apoptosomu – molekulární základny složené z Apaf-1 (Apoptosis proteases--activating factor-1), dATP, cytochromu c. Uvedené děje ústí v aktivaci kaspasy 9, která štěpí a aktivuje efektorové prokaspasy ^11–14). Vnitřní cesta apoptózy je regulována pro- a protiapoptotickými geny z rodiny Bcl-2, a tudíž kanálovými proteiny Bcl_X a Bcl₂, které udržují normální funkci mitochondriální membrány. Regulace jejich aktivity hraje centrální úlohu při apoptóze. Inhibicí této aktivity se změní permeabilita mitochondriální membrány, což vede k uvolnění cytochromu c z mitochondrií do cytosolu ^{13, 15– 17)}.

Kaspasy

Termín KASPASA (caspasa) patří mezi tzv. zkratková slova (Cysteinyl Aspartate Specific ProteinaseS) ¹⁸⁾.Jedná se o rodinu proteolytických enzymů – cysteinových proteas štěpících proteinovou molekulu s cysteinem v katalytickém místě na fragmenty se zbytky kyseliny asparagové. Kaspasy hrají ústřední roli v procesu apoptózy ^{19, 20)}.

Struktura a klasifikace kaspas

Vztah kaspas k apoptóze byl objeven v souvislosti s výzkumem červa Caenorhabditis elegans, přičemž bylo prokázáno, že produkt genu ced-3 je homologní se savčím interleukin-1 ß-konvertujícím enzymem (ICE, kaspasa 1). Později byla objevena celá řada příbuzných enzymů nazývaných kaspasy 2–14 ^{21, 22)}.

Kaspasy mají podobnou sekvenci aminokyselin, strukturu a substrátovou specifitu. Všechny jsou exprimovány jako proenzymy a obsahuji tři hlavní domény: NH₂ terminální doménu, velkou podjednotku (20 kD) a malou podjednotku (10 kD). NH₂ terminální doména je vysoce variabilní a hraje roli v regulaci aktivace; velká a malá podjednotka tvoří po rozštěpení heterodimery. Kaspasy mají společný koncový pentapeptid QACXG, ve kterém X může být: R – arginin, Q – glutamin, D – kyselina asparagová (A – alanin, C – cystein, G – glycin). K proteolýze substrátu je v místě štěpení nezbytně nutná přítomnost kyseliny asparagové ^{22, 23)}.

Dělení kaspas dle funkce se prolíná s jejich dělením dle substrátové specifity:

• Kaspasy iniciační – jsou aktivovány v počáteční fázi apoptózy (kaspasa 2, 8, 9 a 10).
• Kaspasy efektorové (exekuční) – jsou to výkonné kaspasy, které jsou aktivovány v efektorové fázi (kaspasy 3, 6, 7).
• Kaspasy zánětu (inflamatorní) – jsou považovány za mediátory, účastnící se zánětu a nekrózy (kaspasa 1, 4, 5, 11, 12, 13, 14) ^24–26).

Kaspasy důležité pro apoptózu zahrnují kaspasy 2, 3, 6, 7, 8 a 10. Hlavními regulátory aktivity kaspas je aktivace kaspasy 8 při indukci apoptózy receptorovou cestou, a aktivace kaspasy 9 při indukci apoptózy nereceptorovou cestou. Obě tyto kaspasy pak indukují aktivaci ostatních prokaspas ^{19, 24)}.

Kaspasy jsou syntetizovány v inaktivní formě jako proenzymy. Aktivovány jsou buď autokatalytickým štěpením, nebo jinými proteasami. Prokaspasa je ve specifických místech Asp-X štěpena, dochází k odštěpení CARD, DED domén, rozštěpení malé a velké podjednotky. Malá a velká podjednotka se pak společně váží za vzniku aktivního tetrameru ^27, 28).

Patologické projevy apoptózy

Studium programované buněčné smrti se stalo v posledních letech objektem výzkumného zájmu, především z důvodů rozpoznání základní role, kterou apoptóza hraje v normálním vývoji organismu a stejně tak v jeho patofyziologii vedoucí k vývoji mnoha chorob. Tato onemocnění je možné rozdělit do dvou skupin – onemocnění s patologickou inhibicí apoptózy a onemocnění s patologickou indukcí apoptózy ¹⁰⁾.

Do první skupiny zařazujeme onemocnění, ve kterých je apoptóza potlačena (tab. 2). Dochází tak k nekontrolovanému bujení buněk a nedostatečnému odstraňování starých, nepotřebných nebo poškozených buněk. Mezi onemocnění s patologickou inhibicí apoptózy patří nádorová onemocnění (folikulární lymfomy, karcinomy s mutací genu p53, hormon dependentní nádory, jako jsou karcinomy mléčné žlázy, prostaty a vaječníku), autoimunitní choroby (systémový lupus erythematodes, některé typy glomerulonefritid) a virové infekce (způsobené herpesviry a poxviry) ^{29, 30)}.

Do druhé skupiny jsou obvykle zařazovány nemoci, u nichž je apoptóza nadměrná a vede k poškození normálních orgánů a tkání (tab. 3). S patologickou indukcí apoptózy souvisí AIDS, neurodegenerativní onemocnění (Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba, amyotrofická laterální skleróza), myelodysplastické syndromy (aplastická anémie) a ischemická poškození (infarkt myokardu, mozková apoplexie) ^{29, 30)}.

Induktory apoptózy

U látek, které působí jako aktivátory apoptózy, se předpokládá využití k léčbě onemocnění, v jejichž patogenezi se uplatňuje nedostatečná apoptóza.

Do skupiny léčiv schopných indukovat apoptózu je možné zařadit gamcitabin ^{33, 34)}, thalidomid ³⁵⁾, doxorubicin ^{36, 37)} i erektikum sildenafil ³⁸⁾. U některých látek schopných indukovat apoptózu není dosud známo, jakým mechanismem tento proces probíhá. Jedná se pravděpodobně o aktivaci receptorů nesoucích smrtící domény (rodina receptorů TNF), omezení účinků bcl-2 proteinu anebo aktivaci kaspas ³⁹⁾. Při použití těchto látek je však důležité a žádoucí, aby jejich působení bylo zaměřené cíleně na patologické buňky a nedocházelo k farmakologickému vyvolání chorob s nežádoucí indukcí apoptózy.

U některých již běžně užívaných léčiv byl podrobněji zkoumán mechanismus účinku na molekulární úrovni a bylo zjištěno, že na jejich působení se podílí indukce apoptózy, jak je tomu například u protinádorového paklitaxelu a antagonistů α₁ receptorů, užívaných v léčbě benigní hyperplazie prostaty. Tato léčiva indukují apoptózu přímo v nádorových buňkách, resp. u hyperplastických buněk prostaty.

Inhibitory apoptózy

Do této skupiny jsou zařazovány látky schopné inhibovat apoptózu. Prozatím nejsou zavedena do praxe, ale představují potenciální farmaka léčby nemocí, u kterých je apoptóza neregulovatelná nebo nadměrná (např. AIDS, neurodegenerativní choroby, ischemické poškození buněk).

Mezi malé molekuly, které nemají peptidovou strukturu a vykazují inhibiční účinek na apoptózu, patří např. oxid dusnatý, zinečnaté ionty, chinony a dithiokarbamáty ⁴⁰⁾.

Problémem využití látek inhibujících apoptózu je jejich nejen terapeutické, ale i patologické působení v procesech navození prekancerogenních stavů. Proto role antiapoptických léčiv u neurodegenerativních chorob musí být nejprve detailněji prozkoumána ⁴¹⁾. Mezi potenciální léčiva tohoto druhu s předpokládanou inhibicí apoptózy, a to nejčastěji mechanismem inhibice kaspas, mohou být zařazeny například pralnakasan ^{42, 43)} a pralnaskan ⁴⁴⁾, ale ne u všech je mechanismus inhibice apoptózy znám. V patogenezi neurodegenerativních chorob hraje ústřední roli kaspasa 3.

Dosud popsané látky ovlivňující apoptózu, zvláště iniciací kaspas (např. thalidomid, leflunomid, bortezomib) nebo inhibicí kaspas (minocyklin, memantin i adeninové nebo jiné purinové deriváty), jsou strukturálně odlišné. Ovlivnění aktivity kaspas je atraktivním polem pro terapeutické ovlivnění mnoha onemocnění, souvisejících s apoptózou a některými zánětlivými nemocemi. V práci byl studován vliv sloučenin ze skupiny stobadinových ⁴⁵⁾ a purinových derivátů na aktivitu kaspasy 1 účastnící se celé řady patologických stavů ^24–26).

POKUSNÁ ČÁST

Chemikálie

Ethylendiaminotetraoctová kyselina 99,5 % (EDTA), 4-(2--hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonová kyselina 99,5 % (HEPES),dithiothreitol 99 % (DTT) (Aldrich),ethanol pro UV, glycerol p. a. (Lachema), HEPES sodná sůl 99 % (Fluka), chlorid sodný p. a., kyselina chlorovodíková 35 % p. a. (ML chemica), polyethylen glykol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)fenylether pro molekulární biologii (Triton^® X-100), rekombinantní lidská kaspasa 1 z E. coli, specifický substrát pro kaspasu 1 Ac-YVAD-pNA (Calbiochem).

Přístroje

Spektofotometr HELIOS β (ThermoSpectronic), Vortex Nahita (Auxilab).

Metodika

Metodika práce se skládala z příprav tlumivého roztoku HEPES, roztoku substrátu, enzymového preparátu kaspasy 1 a roztoků efektorů vždy včas spotřeby a z vlastní metodiky stanovení biologické aktivity.

Tlumivý roztok HEPES – 0,01 mol.l^-1, pH 7,4

Složení: 0,01 mol.l^-1 HEPES kyselina; 0,01 mol.l^-1 HEPES sodná sůl; 50 mmol.l^-1 NaCl; 10 mmol.l^-1 DTT; 1 mmol.l^-1 EDTA; 5 % glycerol; 0,1 % TRITON^® X-100.

Příprava

V destilované vodě bylo rozpuštěno příslušné množství HEPES kyseliny, HEPES sodné soli, NaCl, glycerolu a TRITONu^® X-100, aby bylo dosaženo požadované koncentrace každé složky a byla upravena hodnota pH pufru na 7,4. DTT a EDTA byly přidány do roztoku až před použitím, aby se zamezilo žloutnutí roztoku ⁴⁶⁾.

Příprava roztoku substrátu

5 mg specifického substrátu pro kaspasu 1 (Mr 628,6) bylo rozpuštěno ve 100 μl DMSO a bylo přidáno 0,7 ml pufru HEPES. Vzniklých 800 μl roztoku bylo rozděleno po 100 μl na 8 dílů (koncentrace 10 mmol.l^-1) a každý z dílů byl dále naředěn přidáním 400 μl pufru HEPES. Vznikly roztoky substrátu o objemu 500 μl a koncentraci 2 mmol.l^{-1 46)}.

Příprava enzymového preparátu z kaspasy 1

Komerčně dodané množství enzymu (300 μl ve formě roztoku s aktivitou 3000 U) bylo rozděleno na 5 částí po 60 μl, každá z částí byla zředěna pufrem HEPES na objem 300 μl (600 U) ⁴⁶⁾.

Příprava roztoků efektorů

Příslušné množství testovaných sloučenin bylo rozpuštěno v 500 μl DMSO tak, aby vznikly roztoky efektorů o koncentraci 10 mmol.l^-1.

Stanovení biologické aktivity

Pro stanovení biologické aktivity bylo pipetováno příslušné množství HEPES pufru, 30 μl připraveného roztoku enzymu a 20 μl (pro koncentraci efektoru 500 μmol.l^-1) resp. 40 μl (pro koncentraci efektoru 1000 μmol.l^-1) roztoku testované sloučeniny tak, aby celkový objem činil 360 μl. Směs byla promíchána za použití přístroje Vortex, inkubována 5 min při teplotě 37 °C. Následně bylo přidáno 40 μl substrátu a směs byla opět důkladně promíchána. Měření absorbance probíhalo při vlnové délce 405 nm oproti slepému vzorku v časových intervalech 10 min po dobu 1 h. Vzorky byly inkubovány během měření při teplotě 37 °C. Zpracované výsledky jsou průměrem vždy dvou paralelních měření. Naměřené hodnoty absorbance odečtené v desetiminutových intervalech byly vyneseny do grafu vůči času a zpracovány lineární regresí. Změna aktivity enzymu byla vypočítána jako podíl absorbance systému s příslušným efektorem k absorbanci systému bez efektoru a vyjádřena v procentech.

VÝSLEDKY A DISKUZE

Působení kaspasy 1 vede k uvolňování p-nitroanilinu z enzymového substrátu, uvolněný p-nitroanilin byl stanoven spektrofotometricky. Nejvyšší hodnota absorbance byla zjištěna ve vzorcích bez přítomnosti efektorů. Přidání efektorů vedlo k poklesu hodnot absorbance svědčící o inhibičním působení testovaných sloučenin na aktivitu kaspasy 1. Hodnoty absorbance byly během měření odečítány v intervalu 10 min po celkovou dobu 1 h, kdy je enzymatická reakce lineární.

Naměřené hodnoty absorbance byly vyneseny na časové ose (graf 1) a byly vypočítány procenta inhibice aktivity enzymatické reakce pro jednotlivé koncentrace efektorů po čase 60 min (graf 2). Z grafu 2 vyplývá, že inhibiční účinek vzrůstá v koncentrační závislosti s množstvím použitých testovaných sloučenin. Nejvyšší inhibiční aktivitu (graf 3) ve skupině studovaných efektorů vykázaly stobadinové deriváty (I–V) (obr. 1), přičemž nejsilnější inhibiční aktivita v koncentraci efektoru 1000 μmol.l^-1 byla nalezena u sloučeniny III, u které dosáhla 82,6 %, sloučeniny IV (75,6 %) a sloučeniny II (62,8 %). Uvedené stobadinové deriváty spojuje strukturální vztah, substituent stobadinového skeletu obsahuje bezprostředně za karbonylovou skupinou alespoň dvouuhlíkatý necyklický alkylový, popř. alkenylový řetězec.

Inhibiční aktivita purinových sloučenin (VI–IX) (obr. 1) je nižší a v koncentraci 1000 μmol.l^-1 dosahuje maximálně 35 % v případě látky VI. Vzájemný vztah mezi aktivitou a chemickou strukturou nelze pro nízký počet studovaných sloučenin prozatím navrhnout.

Došlo: 18. října 2007

Přijato: 29. listopadu 2007

Adresa pro korespondenci:

PharmDr. Bc. Tomáš Bartl

Ústav chemických léčiv FaF VFU

Palackého 1/3, 612 42 Brno

e-mail: tbartl@vfu.cz