Měření koncentrace lipoproteinu(a): co a jak měříme a kudy dál?

Overview

Lipoprotein(a) je atypický lipoprotein, jehož hladina v krvi je geneticky determinována. Dle současných znalostí je samostatným nezávislým rizikovým faktorem pro aterosklerotická kardiovaskulární onemocnění a pro aortální valvulární stenózu. V současné době není k dispozici specifická terapie ke snížení jeho koncentrace v krvi, ale v pokročilé fázi klinických studií jsou nadějné preparáty na principu RNA-interference. Management pacientů s vysokou hladinou Lp(a) bude vyžadovat, aby byla k dispozici spolehlivá metoda měření jeho koncentrace v krvi. V současné době používané metody, které měří koncentraci Lp(a) v hmotnostních jednotkách, nemohou být spolehlivé především pro velmi vysokou variabilitu částice Lp(a). Pro zkvalitnění diagnostiky je nutná standardizace měření s přechodem na měření molární koncentrace Lp(a) s návazností na vhodný mezinárodní standard.

Klíčová slova:

apolipoprotein(a) – LDL-cholesterol – lipoprotein(a) – standardizace měření

Úvod

Lipoprotein(a), dále jen Lp(a), je atypický lipoprotein, kterému je v posledních letech věnována zvýšená pozornost pro jeho účast v patogenezi aterosklerózy a aterosklerotických kardiovaskulárních onemocnění (ASKVO). Lp(a) je komplexem bílkoviny apolipoproteinu(a) a kompletní částice lipoproteinu LDL. V souhrnné publikaci z roku 2022 [1] je konstatováno, že zvýšená koncentrace Lp(a) je nezávislým rizikovým faktorem pro ASKVO a pro aortální valvulární stenózu. Protože jeho koncentrace v krvi je determinována z velké části geneticky a protože v současnosti není k disposici specifická terapie, která by koncentraci Lp(a) snížila, je doporučeno změřit jeho koncentraci u dospělých osob 1krát za život. To se ale pravděpodobně v relativně krátkém výhledu změní, protože v pokročilých fázích klinických studií jsou preparáty na principu RNA-interference, které snižují koncentraci Lp(a) až o 90 %. A to je také důvodem, proč je na Lp(a) upírána zvýšená pozornost klinických lékařů i farmaceutických firem. Nicméně k tomu, aby bylo možné stanovit jasná pravidla pro interpretaci výsledků měření koncentrace Lp(a) v krvi pro nasazení specifické terapie, sledování jejího účinku a stanovení cílových hodnot je nutné, aby existovala spolehlivá laboratorní metoda měření koncentrace Lp(a) v krvi. Měření koncentrace Lp(a) je ale velmi problematické: neexistuje standardizace, existuje více metod jeho stanovení, které nejsou navzájem srovnatelné a existují 2 způsoby vyjadřování výsledků měření, které nelze navzájem přepočítat.

Genetika Lp(a)

Lp(a) byl objeven v roce 1963 genetikem Kare Bergem, který se snažil definovat rozdíly v lipoproteinech lidských sér pomocí souboru imunologických vyšetření. Tehdy objevil nový antigen, který byl navázán na lipoproteiny o nízké hustotě (LDL) [2]. Konstatoval, že tento nový antigen je geneticky determinován a navrhl jeho název „lipoprotein (a)“, přičemž malé „a“ v závorce dle tehdejší terminologie bylo označením pro antigen. Název lipoprotein(a) tedy říkal že jde o nějaký antigen, navázaný na LDL. Oním antigenem je bílkovina apolipoprotein(a) – dále v textu jen apo(a). Následné sekvenování a klonování genu pro apo(a) ukázalo, že tento gen se vyvinul z genu pro plazminogen, že obsahuje několik tzv. kringl domén běžných u koagulačních faktorů a dále mutovanou proteázovou doménu, která postrádá proteolytickou aktivitu plazminu [3]. Tyto analýzy přinesly nové poznatky o složitosti genetiky Lp(a), které mimo jiné pomohly vysvětlit, proč jsou u lidí takové zásadní interindividuální rozdíly v hladinách Lp(a) v plazmě. Ukázalo se, že mezi různými kringly odvozenými od genu pro plazminogen se během vývoje dalšími mutacemi rozšířil a diverzifikoval kringl IV (KIV) do 10 různých typů, označovaných jako KIV1–10, a dále že jeden z nich, typ KIV-2, se může multiplikovat u různých osob do různého počtu kopií. Počet repeticí KIV-2 může kolísat od pouhých 3 až po více než 40 kopií. Pro syntézu jakéhokoliv peptidu/proteinu máme ale vždy dvě alely (od každého z rodičů jednu), a máme tedy i dvě různé alely pro syntézu apo(a). A protože jen málo jedinců má obě alely totožné (homozygotní forma), bylo prokázáno, že více než 95 % populace jsou heterozygoti co se týče variací v počtu kopií KIV-2. Výsledkem výše uvedených faktů je skutečnost, že je u různých osob nejen různá délka řetězce apo(a)-proteinu (různý počet KIV-2), ale že navíc většina z nás vytváří dva různě dlouhé řetězce apo(a) o odlišném počtu KVI-2 [4]. Do problematiky heterogenity apo(a) vstupuje ještě další faktor, kterým je individuální glykosylace jednotlivých kringlů: molekulární hmotnost řetězce apo(a) se tak zvyšuje v závislosti na intenzitě glykosylace jeho kringlů [5]. Protein apo(a) není z výše uvedených důvodů z hlediska složení jednoznačně definovaná substance a je velmi variabilní, což má dopad nejen do problematiky měření koncentrace Lp(a), ale i do kliniky: alela apo(a) s malou variabilitou počtu kopií vede k syntéze apo(a) s kratším řetězcem za vzniku Lp(a), který je asociován s vysokými koncentracemi Lp(a) v plazmě. Naopak alela apo(a) s vysokou variabilitou počtu kopií apo(a) vede k apo(a) s dlouhým řetězcem apo(a) za vzniku Lp(a), který je asociován s nižšími plazmatickými hladinami Lp(a). Na malé populaci bylo tehdy také prokázáno, že variabilita KIV-2 predikuje nejen hladiny Lp(a), ale i riziko ASKVO [6].

Lp(a) jako komplex apo(a) a lipoproteinu LDL

Apo(a), syntetizovaný v hepatocytech, se váže pomocí dis­ulfidického můstku svým kringlem KIV9 na řetězec apolipo­proteinu B částice lipoproteinu LDL, za vzniku kompletní částice Lp(a) [7,8]. LDL jsou produktem degradace VLDL (lipo­proteiny o velmi nízké denzitě) v krvi a jejich složení a velikost LDL je také variabilní. Jejich variabilita se týká jak velikosti (malé, střední, velké LDL), tak i jejího složení (obsahu cholesterolu, triglyceridů, fosfolipidů). Výsledkem vazby variabilního řetězce apo(a) na variabilní částici LDL je skutečnost, že Lp(a) jako celek je extrémně variabilní entita z hlediska velikosti, hmotnosti a složení u různých jedinců i v rámci jednoho jedince. To je také hlavní příčinou problémů se stanovením koncentrace Lp(a) v krvi.

Měření koncentrace Lp(a) v krvi

Poznámka úvodem: Následující text je značným zjednodušením problematiky analytické chemie a biochemie jak z hlediska definice a výkladu jednotlivých pojmů, tak i fyzikálně-chemických principů a postupů při zjišťování koncentrace analytů v krvi. Cílem textu je vysvětlit, jaké problémy přináší měření koncentrace Lp(a).

Laboratorní principy a aspekty měření koncentrace látek v krvi

Koncentrace látek v krvi je v klinické biochemii vyjadřována nejčastěji v látkových (molárních) jednotkách, nebo v hmotnostních jednotkách (v případě enzymů formou jejich katalytické aktivity).

Hmotnostní koncentrace vyjadřuje (zjednodušeně) hmotnost měřené látky v jednotkovém objemu krve. Nejčastěji používanou jednotkou je gram/litr (g/l) a z ní dále odvozené menší jednotky (mg/l, µg/l). V anglosaské literatuře pak stále přežívá obsoletní jednotka mg/dl. Je logické, že měříme-li „hmotnost“ nějaké substance v objemu krve, musíme znát „hmotnost“ měřených částic (molekulární hmotnost), a že „hmotnost“ stanovované látky musí být jasně definovaná její chemickou strukturou a musí být neměnná napříč populací. To platí u běžně stanovovaných analytů (glukóza, močovina, hormony, léky), nikoliv ale u Lp(a).

Látková (molární) koncentrace udává látkové množství (zjednodušeně řečeno počet částic měřené látky) v jednotkovém objemu krve. Nejčastěji používanou jednotkou je mmol/l a z ní dále odvozené menší jednotky (µmol/l, nmol/l). A protože mol je 1 ze 7 základních jednotek soustavy SI, mělo by být používání molární koncentrace používáno preferenčně před hmotnostními jednotkami na předpokladu, že to charakter měřené látky dovoluje.

Princip imunochemických měření

Měření koncentrace Lp(a) v klinických laboratořích se provádí většinou imunochemickou analýzou. Principem imunochemických stanovení koncentrace nějakého antigenu v krvi – hormon, nádorový marker, peptid, apo(a) – je v obecné rovině jeho vazba na specifickou protilátku obsaženou v diagnostické soupravě. Protilátka v diagnostické soupravě musí být specifická vůči stanovovanému antigenu, v případě měření Lp(a) je antigenem apo(a), a velmi důležitý je výběr místa na povrchu stanovovaného antigenu, na které se protilátka váže (jeho dostupnost, specificita apod). Protilátka v soupravě musí být nějakým způsobem „označena“, aby následně vzniklé komplexy antigen-protilátka mohly být detekovány (např. barevnou reakcí, zákalem, chemiluminiscencí) a aby tak bylo možné kvantifikovat množství vzniklých komplexů antigen-protilátka, které je úměrné množství měřeného antigenu v krvi. V případě Lp(a) je nejčastěji používána imunoturbidimetrie, při které je měřena intenzita zákalu způsobeného vznikajícími komplexy antigen-protilátka. Pro zvýšení citlivosti reakce bývají protilátky proti apo(a) vázány na latexové částice. Jedním z dalších předpokladů kvantifikace výsledku měření je existence nějakého referenčního materiálu/standardu (čistého a chemicky jednoznačně definovaného antigenu který měříme), jehož přesně dané množství je „rozpuštěno“ v přesně daném objemu roztoku. Pro měření je dále třeba mít k disposici kalibrátory, což je většinou řada vzorků roztoku tohoto antigenu o známé stoupající koncentraci, ke konstrukci tzv. kalibrační křivky. Z té pak lze při odečíst (ze síly naměřeného signálu) koncentraci měřeného antigenu ve vyšetřovaném vzorku krve.

Měření koncentrace Lp(a) v kontextu výše uvedených informací

Měření Lp(a) v hmotnostních jednotkách (mg/l, mg/dl): tento způsob zatím používá většina firem, dodávajících diagnostické soupravy pro stanovení Lp(a). Hlavní problémy při tomto způsobu stanovení jsou následující:

Vysoká interindividuální heterogenita částic Lp(a), která je dána délkou řetězce apo(a): interindividuální i intraindividuální variabilita v počtu KIV-2, individuální intenzitou glykosylace kringlů a současně velikostí a složením částice LDL (individuální obsah cholesterolu, fosfolipidů a triglyceridů). Hmotnost částice Lp(a) je dána součtem hmotnosti řetězce apo(a) + hmotnosti částice LDL a kolísá mezi 300–800 kDa [5,9]. Neznáme-li ale „hmotnost“ částice Lp(a) u konkrétní osoby, lze jen těžko přesně stanovit „hmotnost“ těchto částic v litru či decilitru krve. Lze proto předpokládat, že pro výpočet koncentrace Lp(a) v soupravách, které stanovují koncentraci v hmotnostních jednotkách, využívají výrobce diagnostických souprav nějakou aproximaci na „průměrnou“ nebo „nejčastější“ hmotnost částice Lp(a) v populaci, a to v návaznosti na kalibrátory výrobce příslušné diagnostické soupravy.

Vysoká variabilita v počtu repeticí kringlů IV-2 v řetězci apo(a) je problémem i při výrobě protilátky pro stanovení Lp(a) v diagnostické soupravě. Většina výrobců souprav pro stanovení v hmotnostních jednotkách používá polyklonální protilátky proti apo(a). Ty mohou rozeznávat různé epitopy řetězce apo(a) a mohou se vázat i na více míst na repetice kringlů IV-2 [10]. V případě velkého počtu repeticí, tedy velké izoformy apo(a), tak většinou tyto soupravy nadhodnocují výsledky, a naopak v případě malého počtu repeticí KIV-2, tedy malé izoformy Lp(a), výsledky podhodnocují. A protože u osob s vysokou koncentrací Lp(a) bývají většinou přítomny malé izoformy Lp(a), je podhodnocení výsledku daleko větší u osob s vysokou koncentrací Lp(a) než u osob s nízkou koncentrací Lp(a). To může vést k výraznému podhodnocení rizika ASKVO u těchto osob [11–14].

 

Stanovení Lp(a) v látkové (molární) koncentraci. Tento způ­sob stanovení do značné míry eliminuje výše uvedené problémy. Soupravy pro toto stanovení používají monoklonální protilátku s vysokou specifitou pro tu část řetězce apo(a), která se neopakuje, např. proti části KIV-9, nebo KV, ev. mohou být použity i 2 monoklonální protilátky pro 2 vysoce specifické epitopy apo(a). Tím je odstraněna variabilita výsledku měření, způsobená počtem repeticí kringlů IV-2. Tím, že je měřen počet částic Lp(a) a nikoliv jejich hmotnost, je odstraněn i problém daný heterogenitou částic Lp(a): v tomto případě zjišťujeme počet částic Lp(a) bez ohledu na jejich velikost, složení a hmotnost. Měření molární koncentrace Lp(a) pomocí výše uvedené monoklonální protilátky tak není ovlivněno izoformami Lp(a), počtem kringlů, jejich glykosylací, ani velikostí a složením LDL [14]. Nevýhodou stanovení koncentrace Lp(a) v nmol/l je to, že není zohledněna velikost částice Lp(a). Je známé, že aterogenita částic Lp(a) závisí nejen na jejich počtu, ale i velikosti [1].

Standardizace měření Lp(a): problémem je především získání základního „standardu“ („standardní“ částice Lp(a) o přesně definovaném složení), od něhož se budou odvíjet sekundární navázané standardy výrobců souprav. Získání standardu je jednoduché u analytů se známou a jednoznačnou molekulární strukturou a hmotností, stejnou napříč populací (glukóza, močovina). Pro měření koncentrace Lp(a) v molárních jednotkách by to mohl být rekombinantní apo(a) – vyvíjený standard ve formě rekombinantního apo(a) se 14 KIV a přesně definovaným složením [15]. Na takovýto „mezinárodní standard“ pro Lp(a) lze navázat sekundární standardy výrobců jednotlivých souprav pro stanovení Lp(a) v molárních jednotkách a dosáhnout toho, že měření jednoho vzorku krve v různých laboratořích i při použití souprav různých výrobců bude srovnatelné a s přijatelnou chybou. V současné době nelze výsledky měření stejného vzorku z různých laboratořích (především v hmotnostních koncentracích) mezi sebou porovnávat. Bias (systematická chyba) se např. při porovnání 6 komerčních souprav pohybovala od -25 do + 35 % [16], v jednotlivých případech konkrétního měření ale mohou být rozdíly mezi jednotlivými měřeními různými soupravami mnohem větší [5].

Doporučení pro měření a interpretaci výsledků měření koncentrace Lp(a)

Protože vztah mezi nárůstem koncentrace Lp(a) a nárůstem rizika ASKVO je lineární a protože měření koncentrace Lp(a) není standardizováno, není pro hodnocení výsledků vhodné uvádět jednoznačné cut-off hodnoty, ale zavést do interpretace tzv. šedou zónu (tab). Výsledky v rozmezí šedé zóny mají být interpretovány opatrně a individuálně v kontextu přítomnosti/nepřítomnosti ostatních rizikových faktorů. Pro správnou interpretaci výsledků by bylo také vhodné, aby laboratoře poskytovaly informace o typu (názvu) použité diagnostické soupravy [1]. Doporučeno je měření koncentrace Lp(a) v molárních jednotkách diagnostickými soupravami, které používají monoklonální protilátky necitlivé k izoformám apo(a) a které jsou navázány na vhodný referenční materiál. Problematikou získání optimálního referenčního materiálu se zabývají pracovní skupiny pro standardizaci měření Lp(a) [15,17].

Přepočet výsledků měření mezi hmotnostními a molárními jednotkami

Přepočet mezi hmotnostními a molárními jednotkami je možný u těch analytů, u kterých je napříč populací jednoznačně dána jejich neměnná molekulová hmotnost (např. glukóza, kreatinin aj). To ale neplatí pro Lp(a), který má vysokou inter­individuální i intraindividuální variabilitu složení a hmotnosti. A pokud nevíme, jaká je molekulární hmotnost částic Lp(a) u konkrétního pacienta, nelze přepočíst počet částic (molární koncentrace) na jejich celkovou hmotnost (hmotnostní koncentrace) a naopak. Přepočet proto není doporučeno provádět [1].

Korekce koncentrace LDL-C na Lp(a)

Součástí Lp(a) je částice lipoproteinu LDL, která vždy obsahuje cholesterol. Když změříme nebo vypočteme koncentraci LDL-C, je ve výsledné hodnotě zahrnut i cholesterol nesený v Lp(a). Lp(a) tedy nadhodnocuje koncentraci LDL-C. Čím vyšší je počet částic Lp(a), tím více je nadhodnocená změřená/vypočtená koncentrace LDL-C oproti skutečnosti. Vznikly proto návrhy korigovat koncentraci LDL-C na koncentraci Lp(a) – odpočet cholesterolu neseného v Lp(a) od změřené/vypočtené hladiny LDL-C. Návrh vycházel z předpokladu, že cholesterol tvoří asi 30–40 % hmotnosti částice Lp(a) [18,19] a výpočet předpokládal stanovení koncentraci Lp(a) i LDL-C v hmotnostních jednotkách, konkrétně v mg/dl. Pokud by teoreticky 30 % hmotnosti částice Lp(a) tvořil cholesterol, pak množství cholesterolu v Lp(a) v mg/dl vypočteme vynásobením koncentrace Lp(a) v mg/dl koeficientem 0,3. Potom by mělo platit, že LDL-C korigovaný na Lp(a) vypočteme tím, že od změřené/vypočtené koncentrace LDL-C v mg/dl odečteme vypočtené množství cholesterolu v Lp(a) v mg/dl. Podrobnější analýzy ale prokázaly, že obsah cholesterolu v Lp(a) kolísá v mnohem širším rozmezí od 6 % do 60 % hmotnostních jednotek [20]. To může souviset s tím, že na hmotnosti částice Lp(a) se významně podílí hmotnost řetězce apo(a), která ale kolísá ve velmi širokém rozmezí v závislosti na počtu repeticí KIV-2. Při vysokém počtu repeticí (např. 40) je částice Lp(a) těžší, většinu její „hmotnosti“ může tvořit velmi dlouhý řetězec apo(a) a na cholesterol „zbývá“ jen např. 10 %. Naopak při minimálním počtu repeticí KIV-2 je řetězec apo(a) krátký, takže cholesterol může tvořit většinu „hmotnosti“ částice Lp(a) a jeho obsah může tvořit např. 60 % celkové hmotnosti Lp(a). Korekce LDL-C na Lp(a) proto může být velmi zavádějící a není doporučeno ji provádět [1]. Výjimkou by snad mohli být pacienti s podezřením na familiární hypercholesterolemii (FH), kteří mají současně velmi vysokou koncentrací Lp(a) [1]. Hladina LDL-C je klíčovým parametrem pro diagnostiku FH a v oblasti rozhodovacích mezí (např. systémem Dutch Lipid Network Criteria nebo MedPed kritéria) vede nadhodnocení LDL-C u osob s vysokou hladinou Lp(a) k nesprávnému stanovení diagnózy FH: pacientův skutečný LDL-C je pod rozhodovací hladinou pro FH (pacient nemá FH), ale cholesterol v Lp(a) hladinu LDL-C falešně zvyšuje a pacientovi je diagnóza FH chybně přiřazena [21,22]. V konsenzu EAS k Lp(a) je uvedeno, že v tomto případě by bylo vhodné koncentraci LDL-C korigovat na Lp(a) a pracovat s takto vypočtenou koncentrací LDL-C [1]. Při použití tohoto postupu by mohlo být „reklasifikováno“ významné procento pacientů s diagnózou FH na osoby bez FH [23]. Nicméně pokud neexistuje spolehlivé měření koncentrace Lp(a), nevíme, jaký je obsah cholesterolu v Lp(a) u konkrétního pacienta a navíc není standardizováno ani měření LDL-C, je třeba považovat výpočet korigovaného LDL-C za velmi nespolehlivý a jen velmi hrubě orientační, nehledě na to, že přechod na měření Lp(a) v molární koncentraci výše uvedený výpočet neumožní provádět.

Závěr

Lp(a) je považován za nezávislý rizikový faktor pro ASKVO a pro aortální valvulární stenózu [1]. V souvislosti s připravovanými léky na principu RNA-interference ke snížení Lp(a) je aktuálním problémem měření koncentrace Lp(a), které není standardizováno, výsledky měření jsou vydávány v různých jednotkách a výsledky z různých laboratoří měřené různými diagnostickými soupravami nejsou srovnatelné. Základní příčinou těchto problémů je především velká inter­individuální i intraindividuální variabilita ve složení a velikosti Lp(a). Cestou ke standardizaci vyšetření je přechod na měření molární koncentrace Lp(a) s využitím monoklonálních protilátek proti neopakujícímu se epitopu na povrchu apo(a), a dále vytvoření mezinárodního standardu/referenčního materiálu.

 

prof. MUDr. Vladimír Soška, CSc. | vladimir.soska@fnusa.cz | www.fnusa.cz

Doručeno do redakce | Doručené do redakcie | Received 30. 8. 2023
Přijato po recenzi | Prijaté po recenzii | Accepted 30. 9. 2023